潘進權

納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶工藝優(yōu)化

潘進權

(湛江師范學院生命科學與技術學院，湛江 524048)

納豆芽孢桿菌是納豆發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌種，對其發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶特性的探討將有助于了解納豆的發(fā)酵生產(chǎn)過程，為其提供理論指導。從不同納豆產(chǎn)品中分離篩選得到一株高產(chǎn)蛋白酶的納豆芽孢桿菌，采用響應面設計的方法對影響其發(fā)酵產(chǎn)酶的若干因素進行了分析，確定了相對較穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝條件:可溶性淀粉 3．41%，麩皮 2%，黃豆粉2．26%，CaCl20．2%，K2HPO40．24%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5;發(fā)酵溫度35～38℃，時間70 h。在優(yōu)化的培養(yǎng)基及條件下，該菌種蛋白酶的發(fā)酵單位可以達到7 200 U/mL，較優(yōu)化前提高了約2倍。

納豆芽孢桿菌 蛋白酶 發(fā)酵工藝 優(yōu)化 響應面法

納豆是一種傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，具有很好的保健及食療價值，這主要與該產(chǎn)品中納豆芽孢桿菌的益生作用、大豆異黃酮、活性多肽及納豆激酶等有密切的關系［1－2］。納豆芽孢桿菌是用于納豆發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌種，屬于細菌科芽孢桿菌屬，其原始菌株與枯草芽孢桿菌相同，是枯草芽孢桿菌的一個亞種。在納豆的發(fā)酵生產(chǎn)中該菌可以分泌多種胞外酶，包括有淀粉酶、脂肪酶、納豆激酶及多種蛋白酶等［3］。這些酶的共同作用賦予了納豆產(chǎn)品特有的風味，以及產(chǎn)品的保健價值。因此對這些酶的研究將有助于了解納豆的發(fā)酵工藝過程，對發(fā)酵生產(chǎn)給予理論指導，同時也可從中發(fā)掘一些有應用價值的新酶。雖然納豆的發(fā)酵生產(chǎn)有悠久的歷史，但是對該菌種胞外酶系的研究卻相對較少，主要的研究工作集中于該菌種益生作用的探討［4－7］，納豆激酶［8－10］的研究與開發(fā)等。然而，對該菌種胞外蛋白酶的研究卻相對較少，僅有少數(shù)學者對該菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶特性進行過探討［11－13］，而對于其胞外蛋白酶的組分構(gòu)成及其催化特性卻鮮見報道。為了探討納豆芽孢桿菌胞外蛋白酶在納豆發(fā)酵生產(chǎn)中的作用，課題組將對納豆芽孢桿菌胞外蛋白酶系的特性進行探討。在前期工作中，從各種納豆產(chǎn)品中分離篩選得到了一株具有蛋白酶高產(chǎn)特性的納豆芽孢桿菌，探討其發(fā)酵特性，為后續(xù)酶的分離純化及性質(zhì)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌(Bacillus natto sp．):實驗室分離保藏菌種。

斜面活化培養(yǎng)基:0．5%葡萄糖，0．5%牛肉膏，1．0% 蛋白胨，0．5%NaCl，1．5% 瓊脂，pH 7．0。液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖2%，蛋白胨 1%，牛肉膏0．5%，NaCl 0．5%，Tween 80 0．1%，pH 7．0?；A發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖2%，大豆蛋白胨1%，硫酸銨0．5%，Na2HPO40．1%，NaH2PO40．1%，CaCl20．02%，MgSO40．1%，pH 7．0。

UV－2000型分光光度計:尤尼柯上海儀器公司;SC－A型精密恒溫水浴鍋:寧波萊福公司;SPX－250B－Z型生化培養(yǎng)箱:上海博訊實業(yè)有限公司;HYQ45型全溫搖床:武漢匯誠生物科技有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 種子活化

菌株經(jīng)斜面活化后，接種一環(huán)于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37℃，200 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h。

1．2．2 發(fā)酵方法

每個250 mL三角瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接種2 mL活化的液體種子，置于全溫搖床于37℃，培養(yǎng)72 h。

1．2．3 單因素試驗

分別以3%的碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、麩皮)，2%的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NaNO3、(NH4)2SO4、黃豆粉)，0．1% 無機鹽(MgCl2、CaCl2、ZnSO4、KH2PO4、K2HPO4)和 0．05%無機鹽(FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O)代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機鹽，并添加 0．1%Tween 80或Tween 20，其他成分保持不變，進行發(fā)酵試驗篩選碳源、氮源和無機鹽及表面活性劑。以此確定對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶有促進作用的營養(yǎng)成分。

1．2．4 部分析因設計

利用Minitab統(tǒng)計軟件，采用其中的2水平試驗設計，對上述單因素試驗篩選到的因素做進一步的分析，以確定對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著作用的因素，并初步考察各因素間的交互作用。

1．2．5 響應面設計

利用SAS統(tǒng)計軟件，采用響應面分析法中的中心組合設計［14］，對部分析因設計中篩選的因素做進一步考察，以確定其最合適的取值，并由此確定發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。

1．2．6 pH對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)其起始酸堿度到不同 pH(5．0 ～10．0)，按照 1．2．2 的方法進行發(fā)酵試驗，考察了培養(yǎng)基起始pH對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1．2．7 溫度對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其起始pH到8．0，按照1．2．2 的方法分別在不同溫度(25 ～45 ℃)下進行發(fā)酵試驗，考察了發(fā)酵溫度對納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響。

1．2．8 發(fā)酵時間與納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶的關系

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其起始pH到8．0，按照1．2．2 的方法在 35 ℃下進行發(fā)酵試驗，考察發(fā)酵時間與納豆桿菌產(chǎn)蛋白酶的關系

1．2．9 蛋白酶活性測定

采用 Folin 酚法［15］:1．5 mL 離心管中加入 0．3 mL稀釋的發(fā)酵液及0．3 mL 1．5%酪蛋白(溶于0．05 mol/L pH 7．5 的緩沖液)，40 ℃ 反應 10 min，加0．6 mL 0．4 mo1/L的三氯乙酸終止反應，靜置15 min后14 000×g離心10 min，取上清液 0．6 mL，加入3 mL 0．4 mol/L碳酸鈉溶液及 0．6 mL福林酚試劑，于40℃顯色20 min，于680 nm測定其吸光值，根據(jù)標準曲線計算酶活單位。

酶活定義:試驗條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1μg當量酪氨酸所需的酶量為1個活力單位。

2 結(jié)果與討論

2．1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2．1．1 單因素試驗

納豆芽孢桿菌利用各種碳源、氮源及無機鹽發(fā)酵產(chǎn)酶的效果有所不同。相比而言，在試驗的幾種碳源中，可溶性淀粉及麩皮發(fā)酵產(chǎn)酶的單位最高，這與枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的特點相似［16］。分析其原因，這可能與該菌的發(fā)酵產(chǎn)酸有關。用淀粉類碳源時，由于碳源利用速率相對較緩慢，發(fā)酵產(chǎn)酸較少，不會導致酸的積累而使pH大幅度下降;而用其他糖作為碳源時產(chǎn)酸速度較快，pH明顯下降，從而在一定程度上影響了酶的合成。在供試的6種氮源中，無機氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的抑制作用，單純用無機氮源時該菌種基本上不具有產(chǎn)酶的能力;相比而言，有機氮源比較有利于發(fā)酵產(chǎn)酶，這應該與蛋白酶的誘導表達特性有關系;在有機氮源中，以黃豆粉的效果最佳，這可能與該菌種長期在此氮源環(huán)境中馴化有一定的關系。在試驗的幾種無機鹽中，K2HPO4及CaCl2對發(fā)酵產(chǎn)酶也有明顯的促進作用。除此外，試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，表面活性劑Tween 80對該菌的發(fā)酵產(chǎn)酶也有一定的促進作用。

根據(jù)以上單因素試驗的結(jié)果初步確定了對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶有促進作用的幾個因素:可溶性淀粉、麩皮、黃豆粉、K2HPO4、CaCl2及 Tween 80。

2．1．2 部分析因設計

采用部分析因設計的方法對上述篩選的因素做了進一步的分析，以此來確定對該菌種發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著影響的因素。表1、表2、表3分別給出了部分析因設計的因素水平、試驗設計結(jié)果及結(jié)果的回歸分析。

表1 部分析因設計因素水平表

表2 部分析因試驗設計及結(jié)果

從表3的分析結(jié)果可以看出:選取的6個因素均對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶表現(xiàn)出促進作用;其中可溶性淀粉(A)，黃豆粉(B)，K2HPO4(D)對發(fā)酵產(chǎn)酶有極顯著的作用(P＜0．01);麩皮(C)對發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的作用(P＜0．05);曲率分析(表3 Ct Pt項)的結(jié)果則表明，部分析因設計確定的試驗空間是一個顯著的曲面響應(P＜0．01)，其中存在最大或最小響應點。為了確定此試驗空間內(nèi)的極值響應點，后續(xù)的試驗將以因素A、B及D為對象，在表1所示的各因素水平的取值范圍內(nèi)進行中心組合試驗設計及響應曲面分析，同時固定其他因素C、E和F的取值為中水平。

表3 部分析因試驗結(jié)果的回歸分析

2．1．3 中心組合設計

在以上試驗結(jié)果的基礎上進行了中心組合試驗設計，考察了可溶性淀粉(A)、黃豆粉(B)和K2HPO4(D)3者的相互作用，試驗設計及結(jié)果如表4所示。

表4 中心組合試驗設計及結(jié)果

對表4的試驗結(jié)果進行回歸分析，可以擬合得到以下數(shù)學模型:

分析表明，回歸模型具有非常高的顯著性(P＜0．01)，其 R2為 0．990 1，說明該模型可以解釋99．01%的試驗結(jié)果。圖1、圖2給出了擬合模型的響應曲面及等高線圖，該曲面的形狀及相應的等高線圖說明在所選取的試驗空間中存在最大響應值。利用SAS軟件分析確定了該最大響應值為(5 159．2±32．6)U/mL，其對應的因素水平分別為可溶性淀粉3．58%，黃豆粉 2．49%，K2HPO40．234%。由此確定了納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:可溶性淀粉3．58%，黃豆粉 2．49%，麩皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%。以優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基按照1．2．2的方法進行發(fā)酵試驗，4次重復試驗結(jié)果(5 130、5 156、5 170 和5 185 U/mL)與模型的預測值基本一致，進一步驗證了該模型的可靠性。

根據(jù)以上優(yōu)化的試驗結(jié)果確定了納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:可溶性淀粉3．58%，黃豆粉2．49%，麩皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%。

2．2 pH對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

考察了培養(yǎng)基起始pH對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)基起始pH對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

pH對該菌種發(fā)酵有較顯著的影響，起始培養(yǎng)基的酸性或堿性太強均不利于菌體產(chǎn)酶;相比而言，弱堿性的條件更有利于該菌種發(fā)酵產(chǎn)酶。根據(jù)試驗結(jié)果確定發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH在8．0～8．5的范圍較為合適。

2．3 溫度對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

考察了溫度對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

溫度對該菌發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的影響:當溫度低于30℃時，發(fā)酵產(chǎn)酶受到明顯的抑制;溫度高于40℃時，酶的產(chǎn)量也受到一定的影響，這可能與酶的失活有關;相比而言，該菌種比較合適的發(fā)酵產(chǎn)酶溫度在35～38℃范圍。

2．4 時間與納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的關系

探討了納豆芽孢桿菌發(fā)酵時間與產(chǎn)酶之間的關系，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵時間與菌體產(chǎn)酶的關系

在發(fā)酵的前期(20 h內(nèi))，菌體產(chǎn)酶的速度非常緩慢;發(fā)酵40 h后菌體進入快速產(chǎn)酶期，而且產(chǎn)酶基本上以恒速進行;發(fā)酵60 h后產(chǎn)酶速度逐漸減慢，發(fā)酵到72 h后產(chǎn)酶基本上結(jié)束，繼續(xù)發(fā)酵將導致酶活的下降。由此確定該菌種合適的發(fā)酵時間為70 h左右。

3 結(jié)論

在納豆發(fā)酵過程中，大豆蛋白的水解是其中一個重要的生化過程，其與納豆的營養(yǎng)保健價值及風味形成有著密切的關系，因此對這一過程的探討對于該產(chǎn)品有著重要的意義。通過對不同來源的納豆產(chǎn)品進行分離篩選，獲得了一株具有高產(chǎn)蛋白酶特性的納豆芽孢桿菌。采用單因素試驗、部分析因試驗、中心組合設計及響應面分析對其發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)基及條件進行了優(yōu)化，確定了較合適的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件:可溶性淀粉3．58%，黃豆粉2．49%，麩皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5，溫度35 ～38 ℃，發(fā)酵70 h左右。在優(yōu)化的基礎上，該菌種蛋白酶發(fā)酵單位可以達到7 200 U/mL，比優(yōu)化前提高約2倍。這一結(jié)果為后續(xù)蛋白酶組分特性及催化性質(zhì)的分析奠定了工作基礎。

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Technical Optimization of Protease Production by Bacillus Natto

Pan Jinquan
(School of Life Science and Tech－nology，ZhanJiang Normal University，Zhanjiang 524048)

Bacillus natto was the primary microorganism used in the production of natto，and the study on the process of protease production from Bacillus natto might help to conduct the production of natto．One Bacillus natto of high－yield protease was isolated from natto，and its protease production process was optimized using the response surface methodology．After optimization，the optimum fermentation medium and conditions were obtained:soluble amylum 3．41%，wheat bran 2%，soybeans powder 2．26%，CaCl20．2%，K2HPO40．24%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5，fermentation temperature 35 ～38 ℃ and time 70 h．Under these optimized conditions，the maximum protease production reached 7 200 U/mL，which increased 2 times than that under the initial conditions．

Bacillus natto，protease，fermentation process，optimization，response surface methodology

Q939．97

A

1003－0174(2011)09－0033－05

時間:2011－07－06 17:00

網(wǎng)絡出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20110726．1700．001．html

CNKI:11 －2864/TS．20110726．1700．001

廣東省自然科學基金(9452404801001943)，湛江師范學院基金(ZL0912)

2010－12－19

潘進權，男，1978年出生，講師，酶與發(fā)酵工程