楊新杰，萬德光，劉 敏，林貴兵，王金燕，嚴(yán)鑄云

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610075

丹參水溶性成分的地域分布特點(diǎn)分析

楊新杰，萬德光，劉 敏，林貴兵，王金燕，嚴(yán)鑄云*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610075

分析全國(guó)不同產(chǎn)地丹參中水溶性成分的含量變化情況及其地域分布特點(diǎn)。采用HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地丹參水溶性成分的含量，運(yùn)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析丹參水溶性成分相關(guān)性及其地域分布特點(diǎn)?；貧w分析表明，丹參素與丹酚酸A含量呈負(fù)相關(guān)，原兒茶醛與迷迭香酸含量呈負(fù)相關(guān)，咖啡酸與丹參素含量呈負(fù)相關(guān)，丹酚酸B與丹酚酸A、丹參素含量呈正相關(guān)。聚類分析表明，三個(gè)野生藥材與山東和河南大部分產(chǎn)地、四川中江栽培藥材水溶性成分較高聚為一類。建議丹參藥材中丹參素≥0.14%，原兒茶醛≥0.01%，咖啡酸≥0.01%，迷迭香酸≥0.17%，丹酚酸B≥3.0%，丹酚酸A≥0.01%。丹參的水溶性成分呈現(xiàn)地域性差異，傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)的含量較高。

丹參;丹參素;原兒茶醛;咖啡酸;迷迭香酸;丹酚酸B;丹酚酸A;HPLC

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根莖，為常用中藥材，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩等功效［1］。其主要成分為脂溶性成分和水溶性成分兩大類。丹參中水溶性成份主要為丹酚酸類化合物，藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抗血栓、抗氧化、改善血液循環(huán)等作用［2］。近年來，不少學(xué)者開展了不同產(chǎn)地丹參的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，但不同學(xué)者的研究結(jié)果各不相同［3-6］。本文采用平行采樣和平行分析方法，對(duì)四川、山東、河南、河北、陜西、山西、江蘇等7省28個(gè)主產(chǎn)地的丹參藥材，進(jìn)行了丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A等6種水溶性成分的HPLC分析，為廣大藥檢、藥材生產(chǎn)、加工、購(gòu)銷及使用人員提供參考。

1 儀器與材料

Varian Prostar系列高效液相色譜儀:包括Prostar 210泵、Prostar 325二極管陣列檢測(cè)器和Prostar色譜工作站(美國(guó)Varian公司);25 μL手動(dòng)進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠);電子天平(Made by Sartorius BP121S);BRANSON SB-2200型超聲儀。乙腈(色譜純，Tedia Company，Inc.)，水為重蒸去離子水，甲酸(分析純，批號(hào)20070815，成都市科龍化工試劑廠)。

原兒茶醛(批號(hào)110810-200506)、丹參素(批號(hào)110855-200508)、丹酚酸B(111562-200605)、咖啡酸(批號(hào)110885-200102)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。迷迭香酸(批號(hào)080406)、丹酚酸A(批號(hào)080412)均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

2007年11月在丹參各主產(chǎn)區(qū)采集栽培或野生丹參的根(產(chǎn)地情況見表2)。采用平行采樣，每份樣品為20～25點(diǎn)采集，樣品采集后快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)常規(guī)加工處理。樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定為丹參Salvia mihiorrhiza Bge.的根。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱:phenomenex Gemini C18柱(250×4.6 mm，5 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司)

流動(dòng)相:A相為水-乙腈-甲酸(90∶10∶0.4)，B相為乙腈，梯度洗脫，A相:0～40 min，100% ～70%;B相:0～40 min，0%～30%。

流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。

2.2 對(duì)照品的配制

分別精密稱取對(duì)照品置棕色量瓶中，以甲醇為溶劑，配制成單組分對(duì)照品溶液，再配制混合對(duì)照品溶液，其中含丹參素116.98 μg/mL、原兒茶醛25.92 μg/mL、咖啡酸37.36 μg/mL、迷迭香酸132.00 μg/ mL、丹酚酸B 2200.00 μg/mL、丹酚酸A 27.20 μg/ mL。

2.3 供試液的制備

取丹參藥材粉末(過三號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水10 mL，密塞，稱定重量，加熱回流提取2 h，冷卻后再稱定重量，加水補(bǔ)足減失重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取上述混合對(duì)照品溶液1、2.5、5、10、15、20 μL，按確定色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系Table 1 Linearing of standard compounds

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5次，所測(cè)原兒茶醛、丹參素、丹酚酸B、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸A六個(gè)組分的峰面積的RSD分別為:1.37%、0.82%、1.20%、0.81%、0.88%、1.26%。

3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一丹參藥材，精密稱取5份，按2.3項(xiàng)下制備方法處理，進(jìn)樣分析，測(cè)得樣品中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的RSD分別為1.27%、0.98%、1.59%、1.96%、0.54%和1.18%。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得樣品中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的RSD分別為1.55%、1.93%、 0.70%、1.66%、1.94%和1.82%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的丹參樣品適量共9份，3份為一組，分別加入3種不同濃度(樣品含量的80%、100%和120%)的混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)制備方法處理，進(jìn)樣后計(jì)算含量。丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的平均回收率分別為 99.55%、98.31%、99.59%、100.29%、99.94% 和 101.13%;RSD分別為2.27%、2.94%、2.44%、1.83%、0.88%和1.64%。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地丹參藥材，按2.3項(xiàng)供試品制備方法處理，進(jìn)樣20 μL分析，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)試結(jié)果Table 2 Determination results of samples(%，n=4)

22 山西芮城東壚鄉(xiāng)(栽培) 0.445 0.032 0.025 0.383 6.28 0.023 23 山西曲沃北董鄉(xiāng)(栽培) 0.361 0.027 0.036 0.252 6.05 0.029 24 山西襄汾汾城鎮(zhèn)(栽培) 0.254 0.024 0.042 0.381 5.52 0.019 25 陜西商洛元明村(栽培) 0.292 0.035 0.034 0.227 3.47 0.017 26 陜西藍(lán)田玉山鎮(zhèn)(栽培) 0.291 0.034 0.034 0.289 7.90 0.048 27 江蘇射陽洋馬鎮(zhèn)(栽培) 0.303 0.028 0.017 0.241 5.11 0.041 28 江蘇贛榆門河鎮(zhèn)(栽培) 0.283 0.029 0.043 0.347 5.19 0.038

4.2 水溶性成分的相關(guān)性分析

采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)6種丹參水溶性成分進(jìn)行回歸分析，分別得到6種水溶性成分之間的回歸模型，其預(yù)測(cè)值為:

丹參素 =0.00386+4.65027×原兒茶醛 + 0.40554×迷迭香酸 +0.01248×丹酚酸 B－0.74324×丹酚酸A

原兒茶醛 =0.00401+0.1938×咖啡酸 －0.02486×迷迭香酸 +0.08010×丹酚酸 A+ 0.06858×丹參素

咖啡酸 =0.01284+0.04848×迷迭香酸 －0.03343×丹參素－0.59487×原兒茶醛

迷迭香酸=0.03425+0.95231×丹酚酸 A+ 0.83975×丹參素－3.21959×原兒茶醛+2.08220 ×咖啡酸

丹酚酸 B=1.77752+16.72648×丹酚酸 A+ 10.73970×丹參素

丹酚酸A=－0.00028－0.11556×丹參素+ 1.03684×原兒茶醛 +0.08413×迷迭香酸 + 0.00309×丹酚酸B

上式表明，藥材中丹參素與丹酚酸A含量呈負(fù)相關(guān)，原兒茶醛與迷迭香酸含量呈負(fù)相關(guān)，咖啡酸與丹參素含量呈負(fù)相關(guān)。說明所測(cè)的6種水溶性成分除丹酚酸B外其他5種成分在植物體內(nèi)存在明顯底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化關(guān)系。

4.3 水溶性成分與地理相關(guān)性

用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中的Hierarchical cluster analysis對(duì)上述28個(gè)產(chǎn)地的丹參以6個(gè)水溶性成分含量之和及丹酚酸B的含量為變量進(jìn)行聚類分析，所用聚類方法為Average linkage，結(jié)果見圖3。

由圖可見，根據(jù)水溶性成分的含量，可把樣品分為2組，第1組包括1、8、11、16、9、12、20、25、14、21、2、7、10、3、15、17、18、23、27、22、4、5、6、19、26，6個(gè)水溶性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為:3.785～8.596，丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:3.23～7.9;主要包括安徽、山東、河北、陜西、四川及河南的大部分地區(qū)。這與山東、河南、四川中江被認(rèn)為其道地產(chǎn)區(qū)一致，但山東、河南和四川中江的質(zhì)量也存在差別。第2組包括13、24、28，6個(gè)水溶性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為:3.6～6.24，丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:3～5.52;主要包括山西、江蘇及河南的部分地區(qū)。可見丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)與丹參中水溶性成分含量之和成正比，所得結(jié)論與文獻(xiàn)［3］一致。

圖3 不同產(chǎn)地丹參水溶性成分的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of Water-Soluble components in Radix Salviae Miltiorrhizae from different sources

5 討論

5.1 丹參酚酸類成分為水溶性成分，采用水溶液提取為最好［6］?？疾炝顺曁崛?、回流提取、和索氏提取三種提取方法，結(jié)果以回流提取較好;比較回流提取30 min、1、2、3 h，在提取2 h時(shí)丹酚酸B的含量最高，隨回流時(shí)間的增加，有的含量成分增加，推測(cè)丹酚酸B出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化，故選擇回流提取2 h制備樣品。這可能是測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)［3］報(bào)道存在一定差異的原因。

5.2 本實(shí)驗(yàn)對(duì)四川、河南、河北、山西、陜西、山東等地的家種及野生丹參的水溶性成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的丹參藥材的水溶性成分含量存在差異，且同一產(chǎn)地野生丹參藥材中所測(cè)得成分含量比家種的要高，但各產(chǎn)地樣品的丹酚酸B均達(dá)到了中國(guó)藥典的規(guī)定。6種水溶性成分中丹酚酸A在各樣品中含量差異較大，最大可達(dá)7倍。根據(jù)測(cè)定全國(guó)各產(chǎn)地樣品結(jié)果，建議丹參素≥0.14%，原兒茶醛≥0.01%，咖啡酸≥0.01%，迷迭香酸≥0.17%，丹酚酸B≥2.0%，丹酚酸A≥0.01%;依據(jù)道地產(chǎn)區(qū)推斷古代優(yōu)質(zhì)丹參的質(zhì)量:丹參素≥0.25%，原兒茶醛≥0.025%，咖啡酸≥0.03%，迷迭香酸≥0.20%，丹酚酸B≥6.00%，丹酚酸A≥0.025%。

5.3 采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，可知藥材中丹參素與丹酚酸A含量呈負(fù)相關(guān)，原兒茶醛與迷迭香酸含量呈負(fù)相關(guān)，咖啡酸與丹參素含量呈負(fù)相關(guān)，丹酚酸B與丹酚酸A、丹參素含量呈正相關(guān)。聚類分析結(jié)果表明三個(gè)野生藥材與陜西、山東和河南大部分產(chǎn)地、四川中江栽培藥材聚為一類，與歷史上出現(xiàn)以河南、山東、四川為道地產(chǎn)區(qū)相吻合，這些產(chǎn)地的水溶性成分較高。不同產(chǎn)地的丹參藥材質(zhì)量存在明顯差別，故在臨床用藥時(shí)要對(duì)藥材的來源進(jìn)行控制。

5.4 本實(shí)驗(yàn)對(duì)全國(guó)主產(chǎn)地的丹參質(zhì)量進(jìn)行分析中，采用平行采樣和平行分析方法，經(jīng)分析該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足采樣和分析質(zhì)量控制的要求(將另文報(bào)道)，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀反應(yīng)所分析地區(qū)藥材的質(zhì)量。

1 State Pharmacopoeia Committee(國(guó)家藥典委員會(huì)) .Chinese Pharmacopoeia(中國(guó)藥典).Beijing:Chemical Industry Press，2005.52.

2 Xiao PG(肖培根).New Edition of The Chinese Materia Medica(新編中藥志).Beijing:Chemical Industry Press，2002.212.

3 Jin ZZ(金樟照)，Zhu M(祝明)，Zhang WT(張文婷)，et al.Studies on relationship between fingerprints of hydrophilic and hydropholic components in Salvia miltiorrhiza.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2004，35:1174-1177.

4 Chen X(陳幸)，Li WS(黎萬壽)，Xia WJ(夏文娟)，et al.Comparative study on chemical composition in Radix Salviae Miltiorrhizae origin from Zhongjiang Sichuan and other habitats.J Tradit Chinese Med and Res of Tradit Med(中國(guó)中藥雜志)，1997，2:522.

5 Zhao LL(趙磊磊)，Xie K(謝凱)，Zhu SS(朱盛山)，et al.Quality analysis of Radix Salviae Miltiorrhizae from different habitats by HPLC and TLC.J Chin Med Mat(中藥材)，2007，30:646-648.

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Analysis on Geographical Distribution of Hydrophilic Components in Radix Salviae Miltiorrhizae

YANG Xin-jie，WAN De-guang，LIU Min，LIN Gui-bing，WANG Jin-yan，YAN Zhu-yun*
College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicines of Ministry of Education，Chengdu 610075，China

Analyzing the content change of hydrophilic constituents and it’s geographical distribution in Salvia miltiorrhira from different producing area around china.Determining content of hydrophilic constituents in S.miltiorrhira from different producing area by HPLC and using SAS to analyze correlation about hydrophilic constituents in S.miltiorrhira and it’s geogrofic distribution.Regression analysis shows that content of Danshensu and salvianolic acid A present negative correlation，protocatechuic aldehyde and rosemarinic acid present negative correlation，caffeic acid and Danshensu present negative correlation，salvianolic acid B and salvianolic acid A and Danshensu showing positive correlation.Cluster A-nalysis shows that three wild medicinal herbs and the cultivated species in most producing area of Shandong and Hebei province and Zhongjiang in Sichuan are one kind.Their content of hydrophilic constituents are high.We suggested that Danshensu should greater than or equal to 0.14%，protocatechuic aldehyde should greater than or equal to 0.01%，caffeic acid should greater than or equal to 0.01%，rosemarinic acid should greater than or equal to 0.17%，salvianolic acid B should greater than or equal to 3.0%，and salvianolic acid A should greater than or equal to 0.01%.There are differences in hydrophilic constituents in S.miltiorrhira between different producting areas，especially higher in traditional and original location.

Radix Salviae Miltiorrhizae;danshensu;protocatechuic aldehyde;caffeic acid;rosemarinic acid;salvianolic acid B;salvianolic acid A;HPLC

1001-6880(2011)04-0684-05

2009-11-09 接受日期:2010-02-05

國(guó)家十一五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAI09B03-4)

*通訊作者 E-mail:cdtcmyan@126.com

R284.1

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