鄧 欣，方 真*，張 帆，，龍運(yùn)多，曾虹燕

1中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園昆明分部生物能源組，昆明650223;2湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湘潭411105

誘變選育脂肪酶高產(chǎn)菌株及其酶學(xué)性質(zhì)

鄧 欣1，方 真1*，張 帆1，2，龍運(yùn)多1，曾虹燕2

1中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園昆明分部生物能源組，昆明650223;2湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湘潭411105

面包干酵母(Saccharomyces cerevisiae)為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行紫外和微波復(fù)合誘變，得高產(chǎn)突變菌株DX213，高產(chǎn)突變菌株酶活力為635 U/mL，為出發(fā)菌株的1.69倍。菌株富集培養(yǎng)5代，遺傳性狀穩(wěn)定。DX213菌株的最優(yōu)產(chǎn)脂肪酶條件為:培養(yǎng)溫度30℃和培養(yǎng)液pH 7.5。酶學(xué)性質(zhì)研究表明:脂肪酶的最適溫度40℃、最適pH為7.5、脂肪酶在40℃以下穩(wěn)定。Fe3+離子對脂肪酶有激活效應(yīng)，當(dāng)Fe3+離子濃度為0.03 g/mL時，脂肪酶酶活力高達(dá)720 U/mL。

微波;菌株;活性;面包干酵母;誘變

生物柴油作為石化燃料油的重要替代品，具有可再生、易降解、含硫量低和有害物質(zhì)排放量小等優(yōu)點(diǎn)，屬環(huán)境友好型燃料。以植物油、動物油和廢食用油等為原料與低碳醇(甲醇、乙醇、正丁醇等)進(jìn)行酯交換反應(yīng)，產(chǎn)物即為生物柴油(脂肪酸甲酯)，副產(chǎn)物為甘油［1-6］。發(fā)展生物柴油，原料是關(guān)鍵。一般來說，植物油的價格占生物柴油生產(chǎn)成本的70%～80%。中國人口眾多，采用菜子油、大豆油、向日葵油等可食用油為原料制備生物柴油是不可行的，小桐子油不可食用但它與菜子油等可食用油有相似的化學(xué)組成，以小桐子油為原料制備生物柴油的應(yīng)用和推廣正是現(xiàn)階段解決中國能源替代問題的最佳手段［7-11］。中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對小桐子進(jìn)行遺傳改良研究，獲得高產(chǎn)、高油和抗逆的轉(zhuǎn)基因小桐子優(yōu)良品種-皺葉黑高桐，并在云貴地區(qū)大規(guī)模種植，為生物柴油的產(chǎn)業(yè)化提供原料。中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園生物能源組在自身大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，提出超聲波協(xié)同固定化脂肪酶催化酯交換反應(yīng)制備生物柴油新工藝(CN101230320A)［12］，該工藝具有能耗低、條件溫和、生物柴油收率高等優(yōu)點(diǎn)。本文報道以面包干酵母為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外和微波復(fù)合誘變，得高產(chǎn)脂肪酸突變菌株DX213及其酶學(xué)性質(zhì)，突變菌株DX213價格低廉，催化效果好，可重復(fù)使用，遺傳穩(wěn)定性好，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號CCTCCM 207082。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌株與培養(yǎng)基

面包干酵母(Saccharomyces cerevisiae):澳大利亞賓那斯集團(tuán)(Buns philp＆Company Limited)，所用試劑均為分析純。

斜面培養(yǎng)基(g/L):土豆200.0、蔗糖20.0、瓊脂20.0、pH自然。

復(fù)篩培養(yǎng)液(g/L):橄欖油5.0 mL，蛋白胨4.0、(NH4)2SO43.0、K2HPO42.0、Mg2SO4·7H2O 1.0。

平板分離培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0、橄欖油10.0 mL、(NH4)2SO40.5、NaCl 1.5、K2HPO40.3、Mg2SO4·7H2O 0.15、瓊脂20.0，pH 7.5。121℃滅菌20 min后冷卻到60℃，加入無菌維多利亞藍(lán)(4 mg/100 mL)，倒平板。

1.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的生長培養(yǎng)及粗酶液制備

稱取2 g面包干酵母細(xì)胞置于100 mL無菌水的三角瓶中，28℃培養(yǎng)2～3 d。接種一環(huán)菌懸液于斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～3 d。從斜面培養(yǎng)基上洗脫脂肪酶，置裝有玻璃珠三角瓶中，振蕩25-30 min，使脂肪酶充分分散，離心分離，取上層清液，用磷酸鹽緩沖液調(diào)至pH 7，得脂肪酶酶液。

1.3 誘變選育

紫外線誘變:量取酵母菌懸液5 mL，加入無菌培養(yǎng)皿中，以30 W的紫外照射儀于30 cm處照射，設(shè)定不同的照射時間為不同的UV處理劑量。紫外線照射后，暗修復(fù)2 h。將誘變處理后的脂肪酶懸液作梯度稀釋，各樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并與對照組比較，計(jì)算致死率。將目的菌液涂布于平板分離培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～3 d。

微波誘變:以脈沖頻率為2450 MHz的650 W家用微波爐，分別對相同濃度和體積的酵母菌懸液進(jìn)行輻射處理。每次輻射5 s后使培養(yǎng)皿冷卻，再進(jìn)行輻射，并將照射時間累計(jì)。設(shè)定不同的輻射時間為不同的微波處理劑量，計(jì)算致死率。將目的菌液涂布于平板分離培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～3 d。

篩選方法:在平板分離培養(yǎng)基，挑取單個誘變后顯色圈直徑大、色深的菌落進(jìn)行搖瓶富集初篩、復(fù)篩。

1.4 出發(fā)菌株生長曲線

稱取2 g面包干酵母細(xì)胞置于100 mL無菌水的三角瓶中，30℃富集培養(yǎng)，定時取樣抽濾，測濾出液脂肪酶酶活，菌體用去離子水洗滌，冷凍干燥至恒重，得到該菌種的生長曲線。

1.5 酶活力測定

采用經(jīng)典的橄欖油乳化法測定游離脂肪酶的酶活力，在溫度30℃、pH 7.5條件下每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol油酸的酶量定義為一個酶活單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘變育種

2.1.1 出發(fā)菌株生長曲線

出發(fā)菌株在富集培養(yǎng)液中生產(chǎn)脂肪酶進(jìn)程見圖1。從圖1可知，出發(fā)菌株在較短(12 h)停滯期后，很快進(jìn)入對數(shù)期(12～48 h)，后進(jìn)入穩(wěn)定期，生產(chǎn)脂肪酶穩(wěn)定期為48～72 h，然后進(jìn)入衰亡期。出發(fā)菌株生產(chǎn)脂肪酶出現(xiàn)高峰與酵母生物量進(jìn)入增長高峰的時間一致，在48 h達(dá)酶活力高峰，為375 U/mL。富集培養(yǎng)超過72 h，酶活力逐漸降低。主要是因?yàn)榫w進(jìn)入衰亡期，菌體新陳代謝衰退，酶活性降低之故［13，14］。

圖1 脂肪酶的生長曲線Fig.1 The growth curve of lipase strain

2.1.2 脂肪酶產(chǎn)生菌株誘變選育

為考察最適誘變條件，采用不同的UV和微波誘變劑量對面包酵母進(jìn)行復(fù)合誘變，所得致死率結(jié)果見表1和表2。結(jié)果表明，UV照射20 s以及微波輻射30 s，面包酵母的致死率達(dá)到99%以上。

紫外線誘變:將致死率超過99.0%的照射樣品，經(jīng)平板分離培養(yǎng)初篩，挑選HC值(水解透明圈與菌落直徑之比)相對較大，顯色圈較深的5株復(fù)篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正突變株1株，此正突變菌株DX212酶活為465 U/mL，較出發(fā)菌株提高了24%，選擇DX212作為出發(fā)菌株進(jìn)行微波誘變。

微波誘變:以同樣篩選方式對微波誘變進(jìn)行初篩、復(fù)篩。獲得一株正突變株DX213，其酶活力達(dá)635 U/mL，較DX212提高了36.6%，為出發(fā)菌株的1.69倍。

將5 mL DX213菌株于富集培養(yǎng)液中，每48 h轉(zhuǎn)接一代至5代，每代接種培養(yǎng)測定酶活，結(jié)果為(U/mL):625、610、635、645和620，可初步認(rèn)為該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 致死率與紫外照射時間Table 1 Effect of UV irradiation time on lethal rate

表2 致死率與微波照射時間Table 2 Effect of microwave irradiation time on lethal rate

2.2 誘變育種

溫度和pH是微生物生存的重要外部環(huán)境，也是影響微生物發(fā)酵的重要因素，接入5 mL DX213菌株于富集培養(yǎng)液中，120 rpm振蕩培養(yǎng)，對DX213菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)液初始pH值進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

溫度是影響酶活性的重要因素之一，溫度對酶促反應(yīng)的影響有兩個方面:一方面是當(dāng)溫度升高時酶促反應(yīng)速度加快;另一方面由于酶本身是蛋白質(zhì)，隨著溫度升高逐步變性失活，從而降低酶的反應(yīng)速度。酶的最適反應(yīng)溫度是這兩種過程平衡。在pH 7.5下振蕩培養(yǎng)48 h，選取5℃為梯度考察培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。溫度在20～30℃時，脂肪酶酶活力顯著增加，培養(yǎng)溫度30℃時，培養(yǎng)液脂肪酶活力最大635 U/mL。溫度超過30℃，酶活力逐漸降低。故最佳培養(yǎng)溫度為30℃。

圖2 溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of temperature on lipase production

2.2.2 pH對菌株產(chǎn)酶的影響

pH是影響酶活性的重要因素之一，酶活性的表達(dá)與培養(yǎng)液的帶電性有關(guān)，培養(yǎng)液帶電性影響酶分子的結(jié)構(gòu)特異性，從而影響了酶的活性。DX213菌株在30℃下不同初始pH值培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)48 h，測定培養(yǎng)液中的脂肪酶活，結(jié)果見圖3。從圖3可知，不同初始pH值培養(yǎng)液的脂肪酶活隨pH值(5～7.5)的增加而增大，其中初始pH值為7.5時，酶活力最大，為630 U/mL。pH值超過7.5時，脂肪酶酶活力顯著降低。因此，最佳產(chǎn)酶pH值為7.5。

圖3 pH對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of pH on lipase production

2.3 脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 pH值對酶活的影響

圖4 pH對脂肪酶酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on enzymatic activity

取5 mL游離脂肪酶酶液，不同pH值條件下測定脂肪酶酶活，結(jié)果見圖4，從圖4知，pH 5.0～7.5時，酶活隨pH值的增加而增大，pH為7.5時，脂肪酶酶活最大，高達(dá)645 U/mL。隨pH值繼續(xù)增大，脂肪酶活力隨著pH值的升高而降低，可能由于堿條件激活了游離酶蛋白必需基團(tuán)的電離，酶出現(xiàn)水解、脫氨基和外消旋化等現(xiàn)象，從而降低酶活［15-16］。

2.3.2 溫度對酶活的影響

取5 mL游離脂肪酶酶液，不同溫度條件下測定脂肪酶酶活，結(jié)果見圖5，從圖5知，在溫度25～40℃時，酶活力隨溫度的增加而迅速增大，溫度為40℃時脂肪酶酶活力最大650 U/mL。溫度繼續(xù)增大，脂肪酶酶活力隨著溫度的升高而降低，可能由于較高溫度脂肪酶蛋白部分變性或結(jié)構(gòu)特異性發(fā)生變化，從而降低酶活。

圖5 溫度對脂肪酶酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on enzymatic activity

2.3.3 脂肪酶熱穩(wěn)定性

圖6 脂肪酶熱穩(wěn)定性Fig.6 The thermal stability of the lipase

取5 mL游離脂肪酶酶液，在40、45℃和50℃條件下將酶液保溫，每隔10 min取保溫酶液，在pH 7.5磷酸緩沖溶液中，測定脂肪酶活，結(jié)果見圖6。40℃保溫90 min時其脂肪酶酶活力保持在600 U/ mL，酶活力損失較少。45℃保溫50 min，其剩余酶活力為原酶活力的63.8%，90 min后剩余酶活力僅為原酶活的40%。50℃下脂肪酶的熱穩(wěn)定性較差，50 min時其剩余酶活力下降至原酶活力的46.9%，90 min后剩余酶活僅為原酶活的31.5%。結(jié)果可知，脂肪酶的熱穩(wěn)定性一般，在低于40℃溫度下穩(wěn)定。

2.3.4 激活劑對脂肪酶的影響

添加激活劑如某些金屬離子、多糖、戊醇和表面活性劑于反應(yīng)環(huán)境中可影響酶的氫鍵、靜電作用、疏水作用等，針對不同的酶可用不同的離子或化合物來穩(wěn)定酶的構(gòu)象。Fe3+濃度對酶活力的影響見圖7。從圖7可知，當(dāng)Fe3+濃度較低時，隨著Fe3+濃度的增加，脂肪酶酶活力有較大幅度的提高，F(xiàn)e3+濃度為0.03 g/mL時，脂肪酶酶活力高達(dá)720 U/mL。但當(dāng)Fe3+濃度繼續(xù)增高時，F(xiàn)e3+對脂肪酶的活性起到抑制的作用，脂肪酶的酶活力反而下降。由此可知，F(xiàn)e3+濃度為0.03 g/mL時，對游離脂肪酶的激活效應(yīng)最高。

圖7 Fe3+對脂肪酶酶活力的影響Fig.7 Effect of Fe3+concentration on enzymatic activity

3 結(jié)論

3.1 面包干酵母為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行紫外和微波復(fù)合誘變，得高產(chǎn)突變菌株DX213，高產(chǎn)突變菌株酶活力為635 U/mL，為出發(fā)菌株的1.69倍。菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，遺傳性狀穩(wěn)定。

3.2 DX213菌株的最優(yōu)產(chǎn)脂肪酶條件為:培養(yǎng)溫度30℃和培養(yǎng)液pH 7.5。

3.3 脂肪酶的最適溫度40℃、最適pH為7.5、脂肪酶在40℃以下穩(wěn)定。Fe3+離子對脂肪酶有激活效應(yīng)，當(dāng)Fe3+離子濃度為0.03 g/mL時，脂肪酶酶活力高達(dá)720 U/mL。

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Mutation Breeding of High-yield Lipase Strain and Properties of Lipase

DENG Xin1，F(xiàn)ANG Zhen1*，ZHANG Fan1，2，LONG Yun-duo1，ZENG Hong-yan21Biomass group，Xishuangbanna tropical botanical garden，Chinese academy of sciences，Kunming 650223，China;2School of chemical engineering，Xiangtan University，Xiangtan 411105，China

The mutation strain DX213 was obtained by UV and microwave treatment from Saccharomyces cerevisiae.Its enzymatic activity was 635U/mL，enhanced by 69%.The genetic characters were stable after enrichment culture for five generations.The optimal conditions for producing lipase were culture temperature of 30℃ and pH of 7.5.Enzymatic properties were studied and found that the optimal temperature and pH for the lipase were 40℃ and 7.5，respectively. The enzymatic activity kept stable below 40℃.Fe3+had an activating effect on lipase.The enzymatic activity went up to 720 U/mL when the Fe3+concentration was 0.03 g/mL.

microwave;strain;activity;Saccharomyces cerevisiae;mutation

1001-6880(2011)03-0512-05

2010-01-05 接受日期:2010-04-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2003AA214061)，中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向性項(xiàng)目(KSCX2-YW-G-075)

*通訊作者 Tel:86-871-5190637;E-mail:zhenfang@xtbg.ac.cn

TQ645.1;Q814.9

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