符 穎，朱占軍，黃 帥，斯建勇，魏建和，潘瑞樂

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193

HPLC法測(cè)定銀州柴胡中五種皂苷的含量

符 穎，朱占軍，黃 帥，斯建勇，魏建和，潘瑞樂*

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193

首次建立HPLC法同時(shí)測(cè)定銀州柴胡中柴胡皂苷a、c、d、e和f五種皂苷含量的方法。流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫，柱子為Hibar·RT RP-18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。柴胡皂苷a、c、d、e和f的線性范圍及相關(guān)系數(shù)分別為:21.78～43.56 μg(r=0.9993)，3.94～9.85 μg(r=0.9994)，20.68～51.70 μg(r=0.9998)，1.67～5.57 μg(r=0.9997)，1.91～6.70 μg(r=0.9992);柴胡皂苷a、d的加樣回收率分別為101.5%和98.5%。該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為柴胡藥材多指標(biāo)質(zhì)量分析方法的建立和銀州柴胡藥用提供了參考依據(jù)。

HPLC;銀州柴胡;柴胡皂苷a;柴胡皂苷c;柴胡皂苷d;柴胡皂苷e;柴胡皂苷f

柴胡是一味療效顯著的常用中藥，具有疏肝解郁、升提中氣之功能，主治感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅腹痛、黃疸肝炎及月經(jīng)不調(diào)等。《中國(guó)藥典》(2005年版一部)收載柴胡原植物為傘形科植物北柴胡Bupleurum chinense DC和狹葉柴胡B.scorzonerifolium Willd.的干燥根［1］。由于柴胡臨床用量大，而且主要依靠采挖野生資源，因此，隨著北柴胡和南柴胡資源的減少，該屬多種植物在產(chǎn)地當(dāng)柴胡藥用，造成商品來源十分混雜，質(zhì)量難以控制?，F(xiàn)代研究表明柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分，具有解熱、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，目前多以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量作為柴胡質(zhì)量控制的指標(biāo)，但不同品種柴胡所含的柴胡皂苷a、d有很大差別，有些甚至檢測(cè)不出［2-10］。因此，建立科學(xué)客觀反映柴胡質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已成為當(dāng)前柴胡研究的熱點(diǎn)，其中多指標(biāo)分析方法是主要的研究模式。

銀州柴胡B.yinchowense Shan et Y.Li廣泛分布于甘肅、青海等西北省區(qū)，是當(dāng)?shù)夭窈闹髁髌贩N，但銀州柴胡的化學(xué)成分和質(zhì)量分析未見報(bào)道。本文采用從銀洲柴胡中分離得到的5個(gè)柴胡皂苷單體作為對(duì)照品，對(duì)甘肅產(chǎn)10批銀州柴胡含量進(jìn)行測(cè)定，為柴胡多指標(biāo)質(zhì)量分析方法的建立和銀州柴胡藥用提供了參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

Waters系列高效液相色譜儀，Waters 600 controller，Waters 600 pump，Waters 2487 dual absorbance detector，Waters Empower工作站。電子分析天平(上海天平儀器廠)，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，乙睛、甲醇為色譜純(Fisher公司)。Wahaha純凈水(市售)，提取用甲醇為分析純(北京化工廠)。

柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)分別為:110777-200406和110778-200505)，柴胡皂苷c、e和f為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)IR、MS和NMR等光譜鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC純度檢測(cè)均大于98%。銀州柴胡樣品從甘肅不同產(chǎn)地收集，經(jīng)作者鑒定為植物銀州柴胡B.yinchowense的干燥根。

1.2 色譜條件

色譜柱:Hibar·RT RP-18(4.6 mm×250 mm，5 μm);保護(hù)柱:SecurityGuard(美國(guó) Phenomenex公司);流動(dòng)相:乙腈-水梯度洗脫，洗脫程序見表1 (Table 1);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;進(jìn)樣量:20 μL。在此條件下，五種柴胡皂苷分離良好。

表1 乙腈-水洗脫梯度表Table 1 Elution program

1.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱定柴胡皂苷 a 21.78 mg、柴胡皂苷 c 10.37 mg、柴胡皂苷d 20.68 mg、柴胡皂苷e 5.99 mg和柴胡皂苷f 10.19 mg，分別置于2 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容得對(duì)照品原液。分別吸取不同體積的對(duì)照品原液于1 mL容量瓶中，用色譜甲醇稀釋定容，即得系列混合對(duì)照品稀釋溶液，其中柴胡皂苷 a的濃度依次為 1.089，1.361，1.633，1.905，2.178 mg/mL，柴胡皂苷c為0.197，0.271，0.345，0.419，0.493 mg/mL，柴胡皂苷d為1.034，1.422，1.810，2.198，2.585 mg/mL，柴胡皂苷e為0.0835，0.132，0.181，0.230，0.279 mg/mL，柴胡皂苷f為0.0955，0.155，0.215，0.275，0.335 mg/mL。

1.4 供試品溶液制備

取柴胡藥材粉末(40目)約1 g，精密稱定，置100 mL三角瓶中，精確加入5%氨水甲醇溶液50 mL，密閉，于30℃水溫超聲提取0.5 h，過濾，濾渣用甲醇潤(rùn)洗兩次，每次10 mL，合并濾液，回收至干，殘?jiān)蒙V甲醇定容于5 mL容量瓶，搖勻，微孔濾膜過濾(0.45 μm)，棄初濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.5 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品稀釋溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄90 min的色譜圖，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

柴胡皂苷類成分無(wú)紫外吸收，僅在末端203 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，但在該波長(zhǎng)基線噪音大，梯度洗脫時(shí)基線漂移嚴(yán)重，若選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，乙腈－水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，基線噪音和漂移均較小，且色譜圖與203 nm比較無(wú)顯著差別，因此，選擇210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 樣品制備方法的確定

由于柴胡皂苷a、d在提取過程中受酚類或酸性成分的影響，易使環(huán)氧醚鍵開環(huán)，轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b1、b2，因而通常采用弱堿性溶劑提取原生柴胡皂苷a、c、d。本研究考察了甲醇、30%甲醇、60%甲醇作為提取溶劑(三種提取溶劑中均加入5%氨水)，HPLC測(cè)定結(jié)果表明五種皂苷含量無(wú)顯著性差異，但用30%甲醇和60%甲醇提取時(shí)雜質(zhì)過多，定容困難，并且對(duì)色譜柱損害大，故選5%氨水甲醇作為提取溶劑。

以5%氨水甲醇為提取溶劑，考察了加熱回流提取1 h、30℃水溫超聲提取0.5 h和1 h三種提取方法，HPLC測(cè)定結(jié)果表明五種皂苷含量無(wú)明顯差異，故選用30℃水溫超聲提取0.5 h作為提取方法。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄HPLC色譜圖，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷e和柴胡皂苷f的色譜峰的相對(duì)峰面積RSD值分別為1.24%、1.19%、1.05%、1.29%、1.34%，均小于2%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度考察

精密吸取同一供試品溶液20 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄五種柴胡皂苷的峰面積，其RSD值分別為0.82%、0.57%、0.71%、0.68%、0.92%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品稀釋溶液20 μL注入HPLC儀，記錄峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程分別為:

結(jié)果表明柴胡皂苷a在21.78～43.56 μg，柴胡皂苷c在3.94～9.85 μg，柴胡皂苷d在20.68～51.70 μg，柴胡皂苷e在1.67～5.57 μg，柴胡皂苷f在1.91～6.70 μg范圍內(nèi)對(duì)照品含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 重復(fù)性考察

取同一樣品5份，按供試品溶液制備方法，處理樣品，記錄色譜圖，各主要色譜峰的相對(duì)峰面積RSD分別為:2.94%、2.89%、2.87%、3.51%、3.95%，方法重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的柴胡樣品共6份，每份0.25 g，分別加入柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對(duì)照品原液各100 μL，按供試品溶液制備方法處理，測(cè)定柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，計(jì)算二者平均回收率分別為101.5%(RSD為2.33%)和98.5% (RSD為2.56%)。由于柴胡皂苷c、e、f對(duì)照品量比較少，未進(jìn)行回收率試驗(yàn)研究。

2.4 樣品測(cè)定

根據(jù)測(cè)定方法對(duì)10批銀州柴胡進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)照品及樣品的色譜圖見附圖1及圖2，測(cè)定結(jié)果見Table 2(SSa、SSb、SSc、SSe及SSf分別為柴胡皂苷a、b、c、e和f)。

表2 銀州柴胡中五種柴胡皂苷的含量(%)Table 2 The contents of five saponins in root of B.yinchowense

3 結(jié)論

首次建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定五種柴胡皂苷含量的分析方法，并用該方法對(duì)10批銀州柴胡中五種皂苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明銀州柴胡中柴胡皂苷a、c和d的含量較高，而柴胡皂苷e和f的含量較低。本研究為建立柴胡藥材多指標(biāo)質(zhì)量分析方法及銀州柴胡藥用提供了參考依據(jù)。

從表2中可知銀州柴胡中柴胡皂苷a、c、和d的含量之和為1.40%～2.01%，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的不同產(chǎn)地北柴胡中這三種皂苷的含量之和接近。從柴胡皂苷a、c和d含量這一指標(biāo)，銀州柴胡與北柴胡相似，但銀州柴胡能否作為法定藥材，尚需對(duì)其藥效、毒性等多學(xué)科綜合研究。

1 The Pharmacopoeia Committee of People’s Republic of China.Pharmacopoeia of People’s Republic China，Part I，Beijing:Chemical Industry Press(國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典，一部).Beijing:Chemical Industry Press，2005.198.

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Determination of five saikosaponins in Bupleurum yinchowense by HPLC

FU Ying，ZHU Zhan-jun，HUANG Shuai，SI Jian-yong，WEI Jian-he，PAN Rui-le*
Institute of Medicinal Plant development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China

A method was established for determining five saikosaponins simultaneously，including saikosaponins a，c，d，e and f in the root of Bupleurum yinchowense by HPLC for the first time.Separation was achieved by A Hibar·RT C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm)using acetonitrile and water as the mobile phase with gradient elution at the f1ow rate of 1.0 mL/min，column temperature at 30℃ and the wavelength of UV detection was 210 nm.There were good linear correlations between the studied concentrations of the five saikosaponins and their chromatographic peak areas，and the correlation coefficients were 0.9992-0.9998.The recoveries of saikosaponins a and d were 101.5 and 98.5%，respectively.The RSD of precision and accuracy was less than 3%.This method is simple，accurate and reproducible，and also provides a reference for establishing the multiple-value quality control method for Radix Buplerui and the use of B.yinchowense as a medicine.

HPLC;Bupleurum yinchowense;saikosaponin a;saikosaponin c;saikosaponin d;saikosaponin e;saikosaponinf

1001-6880(2011)03-0494-04

2009-10-12 接受日期:2010-02-04

創(chuàng)新藥物研究開發(fā)技術(shù)平臺(tái)建設(shè)(2009ZX09301-003)

*通訊作者 Tel:86-10-57833286;E-mail:rlpan@implad.ac.cn

R284.2

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