龔鐳 胥明 彭曉斌 唐學(xué)軍 朱穎偉 陸健

·論著·

12-脂氧合酶在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

龔鐳 胥明 彭曉斌 唐學(xué)軍 朱穎偉 陸健

目的檢測(cè)胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株SW1990和PANC1的12-脂氧合酶(12-lipooxygenase,12-LOX)表達(dá),探討其與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法分別應(yīng)用免疫組化染色、RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺癌組織、癌旁正常胰腺組織及胰腺癌細(xì)胞株SW1990和PANC1中12-LOX mRNA 和蛋白的表達(dá)。分析胰腺癌組織12-LOX表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果30例胰腺癌組織12-LOX表達(dá)陰性8例，弱陽(yáng)性7例，強(qiáng)陽(yáng)性15例,總陽(yáng)性率為73.3%。SW1990和PANC1細(xì)胞均表達(dá)12-LOX。陽(yáng)性表達(dá)的胰腺癌組織及兩株胰腺癌細(xì)胞株均表達(dá)12-LOX mRNA，而癌旁正常胰腺組織不表達(dá)12-LOX mRNA及蛋白。胰腺癌組織12-LOX強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤TNM分期、腫瘤病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別無(wú)關(guān)。結(jié)論12-LOX在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。

胰腺腫瘤； 12-脂氧合酶； 病理學(xué)； 免疫組織化學(xué)； 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

脂質(zhì)代謝紊亂是腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織環(huán)氧合酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)表達(dá)增高，且與TNM分期明顯相關(guān)[1]。脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)是另一類(lèi)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶類(lèi)，目前發(fā)現(xiàn)有5-LOX、8-LOX、12-LOX和15-LOX 4種亞型。文獻(xiàn)報(bào)道5-LOX表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]。本研究檢測(cè)胰腺癌組織及細(xì)胞株中12-LOX的表達(dá)，分析其與臨床特征之間的關(guān)系。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

收集本院手術(shù)切除的30例胰腺癌標(biāo)本(男23例，女7例，平均年齡66歲)和9例癌旁正常胰腺組織。胰腺癌細(xì)胞株SW1990和PANC1由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院惠贈(zèng)。RT-PCR試劑盒購(gòu)自Gibco公司。兔抗人12-LOX單抗購(gòu)自abcam公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自長(zhǎng)島公司。生物素標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Cruz公司。

二、方法

1．免疫組化染色：胰腺癌組織石蠟切片，常規(guī)行免疫組化染色。12-LOX單抗工作濃度1∶100，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性染色表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。參考Krajewska等[3]的標(biāo)準(zhǔn)在高倍鏡下隨機(jī)觀(guān)察5個(gè)視野，按陽(yáng)性細(xì)胞比例將0、1%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別計(jì)0～4分；按染色強(qiáng)度將無(wú)、黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)為0～3分，最后綜合兩者得分。如某片有25%黃色(1×1=1)、50%棕黃色(2×2=4)及25%棕褐色(1×3=3)，則總分為1+4+3=8。0分為陰性，1～5分為弱陽(yáng)性，≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性。

2．RT-PCR：取液氮凍存新鮮胰腺組織及2×107個(gè)胰腺癌細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，常規(guī)行RT-PCR。12-LOX引物序列：上游5′-GGCCCG-GACCCAACTCATCTC-3′，下游5′-GGCTTAGGGACC-CAGGCATACCAG-3′，擴(kuò)增片段465 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5′-GTGAAGGTCGAGTCAACC-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，擴(kuò)增片段223 bp。退火溫度為60℃。

3．蛋白質(zhì)印跡法：取5例強(qiáng)陽(yáng)性及3例弱陽(yáng)性胰腺癌組織50 mg或2×107個(gè)胰腺癌細(xì)胞，加入4℃預(yù)冷的胞質(zhì)蛋白提取液1 ml[10 mmol/L HEPES，10 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，10 μg/ml aprotinin、pepstatin、leupetin，50 mmol/L NaF，1 mmol/L NaVO4，20 mmol/L對(duì)硝基苯磷酸]勻漿，4℃ 2000 r/min離心30 s，取上清并加入50 μl 10% NP-40于4℃ 5000 r/min離心1 min，收集上清-80℃保存?zhèn)溆?。常?guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)12-LOX蛋白表達(dá)。兔抗人12-LOX單抗1∶600稀釋。最后ECL顯色。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0軟件分析。12-LOX表達(dá)與臨床病理資料間關(guān)系用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌組織12-LOX的表達(dá)

30例胰腺癌組織12-LOX表達(dá)陰性8例，弱陽(yáng)性7例，強(qiáng)陽(yáng)性15例。癌旁正常胰腺中的胰腺導(dǎo)管內(nèi)皮細(xì)胞及腺泡細(xì)胞均為陰性，部分胰島細(xì)胞呈弱陽(yáng)性染色(圖1)。

圖1胰腺癌組織(a)和癌旁正常胰腺組織(b)12-LOX的表達(dá)(免疫組化 ×200)

二、胰腺癌組織12-LOX表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胰腺癌組織12-LOX強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、腫瘤病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別均無(wú)關(guān)(表1)。

表1 胰腺癌組織中12-LOX的表達(dá)與腫瘤病理參數(shù)的關(guān)系

三、胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞株12-LOX mRNA表達(dá)

陽(yáng)性表達(dá)的胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞株均表達(dá)12-LOX mRNA，而癌旁正常胰腺組織未見(jiàn)12-LOX mRNA的表達(dá)(圖2)。

1:Marker；2:SW1990；3:PANC1；4、5：胰腺癌組織；6：癌旁正常組織

圖2胰腺癌細(xì)胞株、胰腺癌及癌旁正常胰腺組織12-LOX mRNA的表達(dá)

四、胰腺組織及胰腺癌細(xì)胞株12-LOX蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果提示，胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株中均有12-LOX蛋白的高表達(dá)，在癌旁正常胰腺組織中也有微量的12-LOX蛋白表達(dá)(圖3)。

1：SW1990；2：PANC1；3、4：胰腺癌組織；5、6：癌旁正常胰腺組織

圖3胰腺組織及細(xì)胞株中12-LOX的表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

脂氧合酶(LOXs)是不飽和脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶類(lèi)之一,可將花生四烯酸(a rachidonic acid, AA)、亞油酸(linoleic acid,LA)及其他多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩锘钚缘拇x產(chǎn)物,從而影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。12-LOX催化AA形成12-HETE，進(jìn)一步的催化可產(chǎn)生白三烯(leukotriene, LTs)、脂氧素(lipoxin, LXs)、Hepoxilins等生物活性物質(zhì)。體外研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中12-LOX催化AA形成的12-HETE可通過(guò)與12-HETE受體、類(lèi)固醇受體輔激活因子-1、過(guò)氧化物酶體增殖體活化受體(PPARs)、類(lèi)視黃醇X受體和其余核受體結(jié)合,激活多條胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如激活P44/42有絲分裂原活化蛋白激酶和PI3/AKT 激酶等途徑,促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)DNA合成[4-5]。阻斷12-LOX途徑可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。進(jìn)一步研究顯示，12-LOX抑制劑通過(guò)減少抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達(dá),誘導(dǎo)Caspase-3、Caspase-9的激活,PPAR的裂解,證實(shí)12-LOX抑制劑可誘導(dǎo)胰腺癌凋亡發(fā)生[7-8]。

本結(jié)果顯示，人胰腺癌組織高表達(dá)12-LOX，胰島細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)，而正常的胰腺腺泡細(xì)胞和胰管內(nèi)皮細(xì)胞則為陰性。人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC1亦高表達(dá)12-LOX。胰腺癌組織12-LOX的表達(dá)與臨床TNM分期、腫瘤病理分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)，表明12-LOX參與了胰腺癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。

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2011-06-17)

(本文編輯：屠振興)

Expressionandclinicalsignificanceoflipoxygenase-12inhumanpancreaticadenocarcinoma

GONGLei,XüMing,PENGXiao-bing,TANGXue-jun,ZHUYing-wei,LUJian.

DepartmentofGastroenterology,WuxiSecondPeople′sHospital,Wuxi214002,China

XüMing,Email:xm73dr@yahoo.com.cn

ObjectivesTo study the expression of lipoxygenase-12(12-LOX) in human pancreatic adenocarcinoma and its relationship with the clinicopathological parameters.MethodsExpression of 12-LOX in pancreatic carcinoma tissue, pancreatic cancer cell lines SW1990 and PANC1, and adjacent normal pancreatic tissue was detected by using immunohistochemistry, RT-PCR, and Western blot, respectively. The relationship between 12-LOX expression and clinicopathological parameters was analyzed.ResultsExpression of 12-LOX was negative in 8 cases, weak positive in 7 cases and strong positive in 15 cases of pancreatic carcinoma. The overall positive rate in pancreatic carcinoma was 73.3%. The expressions of 12-LOX mRNA and protein were positive in pancreatic cancer cell lines SW1990 and PANC1, and negative in adjacent normal pancreatic tissue. The strong positive expression of 12-LOX in pancreatic cancer was associated with TNM stage, pathological grade, lymph node metastasis(P<0.05).ConclusionsThe expression of 12-LOX was up-regulated in pancreatic cancer and is correlated well to malignant behaviors of tumor.

Pancreatic neoplasms； 12-Lipoxygenase； Pathology; Immunohistochemistry; RT-PCR

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.010

214002 無(wú)錫，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科

胥明，Email:xm73dr@yahoo.com.cn