沈陽 許春芳

·論著·

沙利度胺對人胰腺癌細胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響

沈陽 許春芳

目的觀察沙利度胺(THD)體外抑制人胰腺癌細胞株SW1990增殖及誘導其凋亡的作用。方法應用不同濃度的THD(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/ml)處理胰腺癌SW1990細胞24、48、72 h，用MTT法測定細胞的生長抑制率，流式細胞儀分析細胞周期，AnnexinⅤ/PI檢測細胞凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞Bcl-2、Bax蛋白的表達。結果THD呈濃度和時間依賴性抑制胰腺癌細胞SW1990的生長。200 μg/ml的THD干預使SW1990細胞G0/G1期比例從(41.15±2.23)%上升到(58.83±2.33)%；細胞凋亡率從2.6%增加到28.0%；細胞Bax蛋白表達量從0.17±0.03上調(diào)到0.33±0.04，Bcl-2蛋白表達量從0.35±0.02下調(diào)到0.17±0.01，Bcl-2/Bax比值從2.17±0.44下降到0.52±0.07。結論THD可以抑制SW1990細胞增殖，其機制可能與上調(diào)Bax蛋白表達、下調(diào)Bcl-2蛋白表達,促進細胞凋亡，將細胞周期阻滯于G0/G1期有關。

胰腺腫瘤； 細胞增殖； 細胞凋亡； 沙利度胺

大約80%的胰腺癌發(fā)現(xiàn)時已存在遠處轉(zhuǎn)移或局部浸潤，手術切除率低，預后極差,進展期胰腺癌的中位生存期僅約6個月。因此，尋求新的安全有效的化療藥物成為許多學者研究的焦點之一。沙利度胺(又名反應停, thalidomide，THD)是谷氨酸的衍生物，目前發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腫瘤作用。本研究應用沙利度胺體外干預人胰腺癌細胞株SW1990，觀察其對細胞增殖、凋亡的影響，探討其作用機制。

材料和方法

一、MTT法檢測細胞增殖

人胰腺癌細胞株SW1990由蘇州大學附屬第一醫(yī)院血液研究所惠贈，常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，按1×104/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl ，培養(yǎng)至80%融合后，分別加入3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/ml的THD(常州制藥廠生產(chǎn)，批號09102213)，同時設空白對照組，每組5個復孔。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl輕輕晃勻，37℃培養(yǎng)4 h，去除上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩混勻10 min，在BIOLISA酶標儀上測定492 nm處的吸光度(A492)值。細胞增殖抑制率=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。實驗重復3次，取均值。

二、流式細胞儀分析細胞周期及AnnexinV/PI細胞凋亡檢測

用50、100、200 μg/ml的THD處理SW1990細胞48 h，用含EDTA的胰酶消化收集細胞，PBS洗滌，離心，70%乙醇4℃固定過夜。PBS洗滌后加RNaseA 37℃水浴30 min，最后加入PI 400 μl。于BIOLISA流式細胞儀上分析細胞周期；另用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，PBS洗滌，加入Binding Buffer 500 μl，加入AnnexinV(FITC)5 μl，混勻后加入5 μl PI，混勻，室溫避光反應5～15 min，于流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

以50、100、200 μg/ml的THD處理SW1990細胞48 h，收集細胞，加入細胞裂解液冰上孵育30 min，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法。設空白對照組。Bcl-2、Bax一抗及二抗均購自江蘇碧云天生物技術研究所，1∶1000稀釋，最后ECL發(fā)光，暗盒曝光、顯影和定影，用明基5000掃描儀掃描。以β-actin作為內(nèi)參。目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示蛋白表達量。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、SW1990細胞增殖的變化

THD基本呈濃度和時間依賴性抑制胰腺癌細胞SW1990的生長(圖1)。6.25、12.5 μg/ml組72 h點的細胞生長抑制率較24 h點顯著增加，≥25 μg/ml各組48、72 h點的細胞生長抑制率均較24 h點顯著增加(P值均﹤0.05)。

與24 h組比較，aP﹤0.05

二、SW1990細胞周期的變化

50、100、200 μg/ml的THD處理SW1990細胞48 h后，G0/G1期比例增多，S期和G2/M期比例減少(表1)。

組別G0/G1期G2/M期S期對照組41．15±2．2334．05±0．8324．80±1．63THD50μg/ml組46．55±2．44a33．00±3．3120．45±0．87a 100μg/ml組53．30±3．17a27．67±3．12a19．02±1．73a 200μg/ml組58．83±2．33a26．30±3．30a14．87±3．28a

注： 與對照組比較，aP<0.05

三、SW1990細胞凋亡率的變化

50、100、200 μg/ml的THD處理SW1990細胞48 h后，細胞凋亡率分別為8.7%、17.1%、28.0%，均較對照組顯著增加(P值均<0.05，圖2)。

四、SW1990細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的變化

THD處理SW1990細胞48 h后，細胞Bcl-2的表達減弱，Bax的表達增強，Bcl-2/Bax比值下降，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05；圖3，表2)。

圖2 各組SW1990細胞的凋亡率

圖3 各組SW1990細胞的Bcl-2、Bax表達

組別Bcl?2BaxBcl?2/Bax對照組0．35±0．020．17±0．032．17±0．44THD50μg/ml組0．28±0．03a0．21±0．03a1．33±0．27a 100μg/ml組0．21±0．02a0．27±0．02a0．77±0．13a 200μg/ml組0．17±0．01a0．33±0．04a0．52±0．07a

注：與對照組比較，aP<0.05

討 論

THD對血液系統(tǒng)腫瘤和實體瘤，如前列腺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤等均具有良好的抗腫瘤作用[1]。其機制廣泛而復雜，不僅具有抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)功能[2]，而且具有抑制細胞增殖、誘導凋亡和阻滯細胞周期作用[3]。本實驗結果顯示，THD呈濃度和時間依賴性抑制SW1990的生長，其中以THD 400 μg/ml作用72 h的增殖抑制作用最為明顯，與Sun等[4]用THD處理肝細胞癌的研究結果相似。

細胞周期調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。申鳳乾等[5]報道，THD能將人結腸癌HCT-8細胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞增殖。本結果顯示，THD處理SW1990細胞后，G0/G1期細胞比例上升，而S、G2/M期細胞比例減少。但Gao等[6]報道，THD對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251-MG的細胞周期無明顯阻滯作用，可見THD對細胞周期的影響可能因腫瘤類型或細胞類型存在差異。

Bcl-2家族分為促凋亡(Bax、Bak、Bad)和抗凋亡(Bcl-2、Bcl-xL)兩類基因。目前研究發(fā)現(xiàn)，Bc1-2/Bax比例平衡是細胞凋亡發(fā)生與否的關鍵因素[7]。本實驗結果顯示，THD處理SW1990細胞后，Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低，與Dmoszynska等[8]研究結果相似。進一步證實THD誘導SW1990細胞凋亡可能與下調(diào)Bc1-2、上調(diào)Bax基因表達有關。

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[2] Stepień H, Lawnicka H, Mucha S, et al. Inhibitory effect of thalidomide on the growth, secretory function and angiogenesis of estrogen-induced prolactinoma in Fischer 344 rats. Life Sci, 2006, 79: 1741-1748.

[3] Wang HY, Zhang M, He PC, et al. Changes of gene expression profile in human myeloma cell line induced by thalidomide. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 2010, 18: 396-402.

[4] Sun P, Zhang LM, Sun DJ, et al. Inhibitory effect of thalidomide on growth of human hepatoma cell line SMMC-7721 cells. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2009, 31: 582-586.

[5] 申鳳乾，王貴吉，崔瑞雪，等.沙利度胺對人結腸癌HCT-8細胞周期及NF-κB、PPARγ表達的影響.中國實用醫(yī)刊，2009,36:49-51.

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2011-01-04)

(本文編輯：屠振興)

EffectsofthalidomideonproliferationandapoptosisinhumanpancreaticcancercelllineSW1990

SHENYang,XUChun-fang.

DepartmentofGastroenterology,JianhuHospital,NantongUniversity,Nantong224700,China

XUChun-fang,Email:xcf601@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of thalidomide on the proliferation and apoptosis in human pancreatic cancer cell SW1990 in vitro.MethodsSW1990 cell line was treated with thalidomide at different concentrations (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 μg/ml) for 24, 48, 72 h, and then cell proliferation were evaluated by MTT. Cell cycle was determined by flow cytometry, apoptosis was determined by annexin V/PI fluos staining, Bcl-2, Bax protein expression and Bcl-2/Bax ratios were measured by Western Blot in vitro.ResultsThalidomide inhibited the proliferation of SW1990 cells in a time and dose-dependant manner. The proportion of G0/G1phase of SW1990 cells with 200 μg/ml thalidomide treatment increased from (41.15±2.23)% to (58.83±2.33)%, apoptosis rate increased from 2.6% to 28.0%, the expression of Bax protein up-regulated from 0.17±0.03 to 0.33±0.04, the expression of Bcl-2 protein down-regulated from 0.35±0.02 to 0.17±0.01, the ration of Bcl-2/Bax decreased from 2.17±0.44 to 0.52±0.07.ConclusionsThalidomide can inhibit the proliferation of pancreatic cancer SW1990 cells by up-regulating Bax, down-regulating Bcl-2, inducing cell apoptosis and cell G0/G1phase arrest.

Pancreatic neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis; Thalidomide

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.008

224700 南通，南通大學附屬建湖醫(yī)院消化科(沈陽)；蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化科(許春芳)

許春芳，Email:xcf601@163.com