王鋒 黃鶴光 陸逢春 陳燕昌

急性壞死性胰腺炎大鼠肺組織水通道蛋白-1的動態(tài)變化及其意義

王鋒 黃鶴光 陸逢春 陳燕昌

重癥急性胰腺炎(SAP)早期常并發(fā)多器官衰竭，其中以呼吸功能衰竭最多見[1]。SAP早期一旦發(fā)生急性肺損傷(ALI)，出現(xiàn)肺水腫、胸水，意味著患者預(yù)后很差[2-3]。本研究觀察水通道蛋白1 (AQP1)在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織中的動態(tài)變化，探討AQP1在肺水腫形成中的作用。

一、材料和方法

1．實驗動物與分組：健康清潔級成年雄性和雌性SD大鼠80只，體重200～230 g，購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按完全隨機法隨機分成ANP組和假手術(shù)對照組，各40只。參考Goldenberg等[4]方法，采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c0.1 ml/100 g體重制備ANP模型。對照組僅翻動胰腺后關(guān)腹。術(shù)后3、6、12、24 h分批處死動物，測胸腔積液量，下腔靜脈抽血及取肺、胰腺組織。

2．血清淀粉酶測定：應(yīng)用全自動生化分析儀(LX20，Beckman, USA)檢測。

3．肺系數(shù)測定：取右肺稱濕重，然后置70℃烤箱中烤2 d至恒重，稱其干重。肺系數(shù)為肺濕、干重比值(W/D)。

4．肺及胰腺組織學(xué)檢測：取左上肺及完整胰腺，置10%福馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，由兩位病理專業(yè)醫(yī)師采用雙盲法讀片，并參照Thome等[5]、Schmidt等[6]標準分別給肺及胰腺病理改變評分。

5．AQP1蛋白表達檢測：采用免疫熒光組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法檢測。取左下肺置4%多聚甲醛+0.3%戊二醛固定液固定，常規(guī)行免疫熒光組織化學(xué)法。兔抗大鼠AQP1的IgG購自Santa cruz biotechnology公司，羊抗兔IgG-FITC購自Abcam公司。另取新鮮的肺組織，用細胞裂解液制備組織勻漿，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法，最后ECL 發(fā)光。

6．AQP1 mRNA表達檢測：采用熒光定量PCR法檢測。應(yīng)用RNAisoTMPlus (TaKaRa公司)提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，在熒光定量PCR儀(PCR ABI 7500)上進行擴增。AQP1引物：上游5′-TCACTTGGCCGAAATGACCTG-3′，下游5′-GTCCCACCCAGAAAATCCAGT-3′(280 bp)；內(nèi)參GAPDH引物： 上游5′-TCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3′，下游5′-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′(320 bp)。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 31 s，40個循環(huán)。

二、結(jié)果

1．大鼠血淀粉酶的變化：ANP組大鼠血清淀粉酶呈時間依賴性明顯升高，峰值在12 h，對照組血淀粉酶無明顯變化(表1)。

2．大鼠胸水量及肺系數(shù)變化：對照組大鼠未見胸腔積液，肺系數(shù)無明顯變化；ANP3、6 h組大鼠未見胸腔積液，12 h組1只大鼠出現(xiàn)胸腔積液，量3 ml；24 h組3只大鼠出現(xiàn)胸腔積液，量3～7 ml，肺系數(shù)隨時間推移逐漸增高 (表1)。

3．肺及胰腺組織病理學(xué)變化：對照組大鼠肺及胰腺組織無明顯病理改變。ANP大鼠肺及胰腺組織隨時間推移病理損傷逐漸加重 (圖1) ，肺、胰腺組織病理評分較對照組顯著升高(P值均<0.01，表1)。

4．肺組織AQP1 mRNA及蛋白表達的變化：ANP大鼠肺組織AQP1 mRNA及蛋白表達從6 h后逐漸減少。而膜表面表達大量AQP1蛋白的紅細胞的數(shù)量隨時間推移而增加(圖2)。

組別只數(shù)時間點血清淀粉酶(U/L)肺W/D肺組織病理評分胰腺組織病理評分對照組403h834±974．5±0．20．1±0．10．1±0．26h794±884．6±0．20．1±0．10．1±0．312h831±934．6±0．20．1±0．10．2±0．324h796±934．6±0．10．1±0．10．1±0．3ANP組403h1528±290b4．9±0．23．7±0．9b4．7±0．5b6h3831±565b5．2±0．2a12．7±2．0b8．4±0．7b12h 6651±1158b5．8±0．3b22．7±1．8b13．8±0．7b24h2417±400b6．5±0．2b29．3±1．1b16．0±0．2b

注：與對照組比較，aP<0.05；bP<0.01

圖1 對照組(a)及ANP 3(b)、6(c)、12(d)、24(e) h組大鼠胰腺(上)、肺(下)組織病理改變(HE ×100)

圖2 對照組(a)及ANP 3(b)、6(c)、12(d)、24(e) h組大鼠肺組織AQP1表達(免疫熒光組化 ×500)

討論水通道蛋白(aquaporin,AQP) 是一族小分子疏水性跨膜蛋白質(zhì)，有極強的水通透性[7]，主要介導(dǎo)自由水被動跨膜轉(zhuǎn)運，速度為(100～200)×10-6m/s，對平衡細胞內(nèi)外環(huán)境起重要作用。AQP在胞膜中形成一個4聚體結(jié)構(gòu)，中間留有孔道，孔道的直徑為3.8，僅能通過一個單水分子，孔道內(nèi)側(cè)帶有正電荷，能阻止帶電荷的小分子通透[8]。目前發(fā)現(xiàn)的APQs有13種(AQP 0～12)[9-11]，在肺組織中有AQP1、3、4、5、8、9等6種AQPs表達[12]。AQP1主要在肺毛細血管內(nèi)皮細胞中表達，肺泡上皮表達較少，其介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運作用占內(nèi)皮細胞膜水通透性的85%。另外，AQP1還分布于臟層胸膜上[13]，維持胸膜腔內(nèi)少量潤滑液的出入平衡。

AQPs在肺水腫形成過程中的作用尚無定論。通過AQPs基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)肺泡和毛細血管間的水通透性降低10～30倍，但對基因敲除模型ALI肺水腫和胸腔積液的形成似乎并無明顯的作用[14-15]。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ALI 后AQP1表達下降，與肺水腫形成具有相關(guān)性。本實驗制備的ANP大鼠模型在早期出現(xiàn)明顯的肺炎癥滲出、水腫，甚至大量胸腔積液，表明ANP并發(fā)了ALI。結(jié)果顯示，ANP大鼠肺組織AQP1 mRNA表達在3 h前短暫增加，6 h后逐漸下調(diào)，且AQP1蛋白表達也逐漸減少，而肺充血、水腫隨時間推移逐漸加重，表明肺AQP1表達水平下調(diào)，嚴重影響了AQP1介導(dǎo)的水分子跨膜轉(zhuǎn)運效率，導(dǎo)致肺泡內(nèi)液清除障礙、肺間質(zhì)內(nèi)液體回吸收減少。因此，肺AQP1可能不是導(dǎo)致SAP肺水腫形成的主要原因，而是AQP1表達下調(diào)及其轉(zhuǎn)運效率下降加快了SAP肺水腫形成過程，加重了肺損傷及肺水腫的嚴重程度，推進了ARDS的進程。

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2010-11-15)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.021

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