胡國(guó)勇 趙嚴(yán) 沈杰 楊麗娟 熊杰 萬(wàn)榮 郭傳勇 王興鵬

·論著·

胰島β細(xì)胞參與急性胰腺炎后胰腺再生過(guò)程的研究

胡國(guó)勇 趙嚴(yán) 沈杰 楊麗娟 熊杰 萬(wàn)榮 郭傳勇 王興鵬

目的探討胰島β細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎(AP)后胰腺再生過(guò)程中的作用。方法SD大鼠87只，按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組(15只)、糖尿病組(24只)、AP組(24只)和糖尿病+AP組(24只)。采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，60 mg/kg體重)或左旋精氨酸(L-Arg，2.5 g/kg體重，2次)方法分別建立糖尿病和AP模型。術(shù)后1、3、5、7 d分批處死大鼠。檢測(cè)血淀粉酶和血糖水平；計(jì)算胰腺濕重比；胰腺組織常規(guī)病理學(xué)檢查，計(jì)算胰腺壞死面積百分比和組織轉(zhuǎn)化區(qū)域百分比；免疫熒光檢測(cè)胰島β細(xì)胞的再生基因(Reg4)和胰島素的表達(dá)。結(jié)果注射STZ后，大鼠血糖明顯升高，注射L-Arg后大鼠胰腺組織水腫、壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血淀粉酶明顯升高，表明制模成功。制模后第3天糖尿病+AP組的胰腺壞死面積為(71.6±6.0)%，顯著大于AP組的(42.3±4.0)%；第7天的組織轉(zhuǎn)化面積為(45.6±5.4)%，顯著小于AP組的(78.5±6.4)%。糖尿病+AP組胰島β細(xì)胞的Reg4和胰島素表達(dá)均較AP組明顯減少。結(jié)論STZ破壞了胰島β細(xì)胞，加重精氨酸誘導(dǎo)的AP的損傷，并抑制胰腺的再生過(guò)程。

急性胰腺炎； 胰島β細(xì)胞； 胰腺再生； 再生基因4

腺泡細(xì)胞的死亡是急性胰腺炎的重要特征，在胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1-2]。精氨酸誘導(dǎo)的急性胰腺炎(AP)腺泡細(xì)胞大量壞死，然而胰島和胰島周?chē)南倥菁?xì)胞卻保留完整，提示胰島和(或)胰島周?chē)南倥菁?xì)胞具有某種機(jī)制使其免于胰腺炎引起的損傷。此外，人類(lèi)慢性胰腺炎時(shí)的胰腺腺泡細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重，而胰島相對(duì)保留完整[3]。上述現(xiàn)象均提示胰島參與了胰腺炎后的抗損傷和修復(fù)過(guò)程。本研究旨在觀察胰島β細(xì)胞在急性胰腺炎后的抗損傷和修復(fù)過(guò)程中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD大鼠87只，SPF級(jí)，200～250 g, 8～9周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前禁食16～18 h，自由飲水。按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組(15只)、糖尿病組(24只)、AP組(24只)和糖尿病+AP組(24只)。以左旋精氨酸(L-Arg，Sigma公司)2.5 g/kg體重腹腔注射兩次、間隔1 h的方法制備AP模型[4]。以鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)60 mg/kg體重腹腔注射一次方法建立糖尿病模型。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，STZ注射3 d后，大鼠出現(xiàn)糖尿病，因此糖尿病+AP組大鼠在STZ注射3 d后再注射L-Arg，故糖尿病組和糖尿病+AP組以STZ注射后第3天為制模當(dāng)天。分別于制模后第1、3、5、7天稱(chēng)取大鼠體重，然后用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，心臟穿刺采血，離心分離血清；完整取出胰腺，去除血管、脂肪和腸系膜等結(jié)締組織后，稱(chēng)取胰腺濕重，再置4%多聚甲醛中固定。

二、血清淀粉酶和血糖的檢測(cè)

血清淀粉酶檢測(cè)采用全自動(dòng)生化儀(Roche公司)；應(yīng)用快速血糖儀檢測(cè)即刻血糖水平。

三、胰腺組織濕重比

根據(jù)處死前大鼠體重和處死后的胰腺濕重，計(jì)算胰腺濕重百分比。

四、胰腺組織病理檢查

將固定的胰腺組織常規(guī)脫水、包埋、石蠟切片、HE染色，光鏡下檢查。參考文獻(xiàn)[6]計(jì)算胰腺壞死面積百分比，參考文獻(xiàn)[7]計(jì)算組織轉(zhuǎn)化區(qū)域百分比。

五、Reg4、胰島素蛋白檢測(cè)

采用免疫熒光方法檢測(cè)。兔抗胰島素單抗和羊抗Reg4多抗購(gòu)自Santa Cruz公司，工作濃度分別為1∶200和1∶50。DyLight549-驢抗羊IgG和DyLight488-驢抗兔IgG購(gòu)自Jackson Immuno Research公司，工作濃度1∶200。最后熒光顯微鏡觀察、攝片。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、血糖的變化

對(duì)照組和AP組大鼠實(shí)驗(yàn)制模當(dāng)天的血糖水平分別為(8.1±1.7)、(8.3±1.2)mmol/L，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糖尿病組及糖尿病+AP組的血糖水平均較對(duì)照組和AP組顯著升高(P<0.01)，且始終維持在高水平，其中制模后第1天的血糖水平最高(表1)。

表1 各組大鼠制模后血糖的變化

注：與對(duì)照組或AP組比較，aP<0.01

二、血清淀粉酶的變化

制模后第1、3、5、7天對(duì)照組血淀粉酶水平分別為(2825±1030)、(2965±108)、(2605±91)、(2600±95)U/L；AP組為(8288±100)、(2751±114)、(2567±91)、(2523±102)U/L；糖尿病組為(2221±113)、(2370±95)、(2150±64)、(2305±107)U/L；糖尿病+AP組為(6777±65)、(1955±161)、(1817±90)、(2098±142)U/L。AP組于制模后第1天顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，第3、5、7天與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；糖尿病組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)；糖尿病+AP組制模后第1天顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，同時(shí)亦顯著低于AP組(P<0.05)，第3、5、7天顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)。

三、胰腺濕重比

制模后第1、3、5、7天對(duì)照組的胰腺濕重比分別為(0.498±0.052)%、(0.518±0.047)%、(0.538±0.052)%、(0.569±0.032)%；糖尿病組為(0.424±0.053)%、(0.431±0.045)%、(0.462±0.029)%、(0.456±0.036)%，均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；AP組為(0.785±0.092)%、(0.509±0.042)%、(0.524±0.062)%、(0.537±0.049)%，第1天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，以后與對(duì)照組無(wú)顯著差異；糖尿病+AP組為(0.613±0.062)%、(0.389±0.037)%、(0.358±0.032)%、(0.392±0.040)%，第1天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，第3、5、7天時(shí)顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)。

四、胰腺病理變化

對(duì)照組大鼠胰腺組織內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)，胰島邊緣規(guī)整，細(xì)胞排列整齊，核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)豐富均勻。糖尿病組和糖尿病+AP組依稀可見(jiàn)1～2 個(gè)胰島細(xì)胞團(tuán)，胰島邊緣不規(guī)整，細(xì)胞排列紊亂，胞核固縮、碎裂，呈多邊形，染色質(zhì)不均勻，有凋亡征象。AP組第1、3天時(shí)可見(jiàn)腺泡細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨后出現(xiàn)導(dǎo)管復(fù)合體，第7天時(shí)導(dǎo)管復(fù)合體逐漸被腺泡細(xì)胞所取代；而糖尿病+AP組第1、3天時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較AP組明顯加重，第7天時(shí)纖維組織沉積，分割胰腺小葉，小葉內(nèi)大量導(dǎo)管復(fù)合體持續(xù)存在(圖1)。對(duì)照組及糖尿病組胰腺壞死面積為3%～4%，無(wú)組織轉(zhuǎn)化。AP組1、3 d的的壞死面積為(54.3±4.6)%和(42.3±4.0)%；5、7 d的組織轉(zhuǎn)化面積為(38.5±4.3)%和(78.5±6.4)%。糖尿病+AP組1、3 d的壞死面積為(65.1±7.0)%和(71.6±6.0)%，顯著大于AP組(P值均<0.05)；5、7 d的組織轉(zhuǎn)化面積為(15.3±2.4)%和(45.6±5.4)%，顯著小于AP組(P值均<0.05)。

圖1 各組胰腺組織病理學(xué)改變(HE ×100)

五、胰島β細(xì)胞胰島素及Reg4表達(dá)的變化

糖尿病大鼠胰腺胰島細(xì)胞的胰島素表達(dá)明顯減少；AP組胰島細(xì)胞胰島素的表達(dá)無(wú)明顯改變，且同時(shí)表達(dá)Reg4和胰島素；糖尿病+AP組胰島細(xì)胞中Reg4和胰島素均明顯減少(圖2)。

圖2AP組和糖尿病+AP組大鼠的胰島Reg4和胰島素表達(dá)(免疫熒光 ×200)

討 論

許多研究表明，精氨酸能夠誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞的壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，然而胰島和胰島周?chē)南倥菁?xì)胞卻保留完整[6-8]。本研究也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，同時(shí)精氨酸誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞損傷后，出現(xiàn)了一個(gè)胰腺自身修復(fù)和再生過(guò)程，即大量導(dǎo)管復(fù)合體的短暫形成，隨后導(dǎo)管復(fù)合體迅速消失，并被再生的腺泡細(xì)胞逐漸取代。Hegyi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CCK(cholecystokinin)類(lèi)似物能夠促進(jìn)胰腺的再生過(guò)程。Takacs等[10]研究也發(fā)現(xiàn)CCK-8能夠加速精氨酸誘導(dǎo)的胰腺炎后的再生過(guò)程，但不能促進(jìn)糖尿病大鼠胰腺炎后胰腺的再生過(guò)程，提示CCK-8促進(jìn)胰腺的再生需要胰島素來(lái)介導(dǎo)。以上結(jié)果提示，胰島細(xì)胞可能在精氨酸誘導(dǎo)的胰腺炎后的再生過(guò)程中起了重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鏈脲佐菌素(STZ)選擇性破壞胰島的β細(xì)胞后，大鼠血糖明顯上升，血清淀粉酶低于正常對(duì)照組，而且胰腺重量明顯低于對(duì)照組，提示胰島細(xì)胞分泌的激素參與了胰腺腺泡細(xì)胞的生長(zhǎng)以及胰酶的合成。盡管AP組大鼠在第1天時(shí)淀粉酶高于糖尿病+AP組，但病理?yè)p傷較該組有所減輕，可能由于胰島素表達(dá)降低而導(dǎo)致淀粉酶的合成減少。在正常胰腺組織中，Reg4僅表達(dá)于胰島細(xì)胞中，而在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，不僅胰島素在胰島中的表達(dá)明顯下降，而且Reg4在胰島中的表達(dá)也明顯減少，提示Reg4可能由胰腺的β細(xì)胞所產(chǎn)生。Reg1是最早發(fā)現(xiàn)的Reg家族成員，特異性表達(dá)于再生的胰島中[11]。隨后研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，Reg1蛋白能夠促進(jìn)β細(xì)胞的增殖從而降低90%胰腺切除和NOD糖尿病模型鼠的血糖水平。Reg4與Reg1為同一家族成員，是否有相似的作用有待于進(jìn)一步的研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠加重了精氨酸誘導(dǎo)的胰腺損傷，同時(shí)也抑制了AP后胰腺自身的修復(fù)和再生過(guò)程。由于胰島素能夠促進(jìn)腺泡細(xì)胞的生長(zhǎng)和胰酶的合成[14]，因此其機(jī)制可能部分與胰島素的分泌減少有關(guān)。此外，除胰島素外，胰島β細(xì)胞還可能分泌其他的因子(如可能包含Reg4)，這些因子也可能參與了AP后胰腺的修復(fù)和再生過(guò)程。結(jié)合我們以前的研究結(jié)果[15]，重組Reg4蛋白能夠減輕精氨酸誘導(dǎo)的胰腺損傷，提示胰島β細(xì)胞通過(guò)分泌Reg4參與了胰腺炎后的抗損傷和修復(fù)過(guò)程。由于胰島細(xì)胞能夠分泌多種因子，因此胰島/Reg4軸在AP后胰腺再生過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步的研究。

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2011-03-01)

(本文編輯：呂芳萍)

Involvementofpancreaticbetacellinpancreaticregenerationfollowingexperimentalacutepancreatitis

HUGuo-yong,ZHAOYan,SHENJie,YANGLi-juan,XIONGJie,WANRong,GUOChuan-yong,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiTenthPeople′sHospital,SchoolofMedicine,TongjiUniversity,Shanghai200072,China

WANGXing-peng,Email:wangxp1965@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the role of pancreatic β cell on pancreatic regeneration following experimental acute pancreatitis.MethodsEighty-seven SD male rats were randomly divided into four groups: control group (n=15), STZ group (n=24), L-Arg group (n=24), STZ+Arg group (n=24). 60 mg/kg of STZ was administrated by intraperitoneal injection to induce the diabetes model. 2.5 g/kg body weight of L-Arg was administrated by intraperitoneal injection to induce the acute pancreatitis model. The rats were sacrificed 1, 3, 5, 7 d later and the serum levels of amylase and glucose were measured. Relative pancreatic weight (pancreatic weight/body weight) were measured. Pancreatic tissue underwent routine pathologic examination, and the percentage of area of necrosis and tissue transformation was calculated. The expression of Reg4 and insulin was performed by immunofluorescence.ResultsSerum level of glucose significantly increased after STZ injection. After L-Arg injection, serum level of amylase significantly increased, and there was pancreatic tissue edema, necrosis, infiltration of inflammatory cells, which suggested the successful model induction. The percentage of area of necrosis in STZ+L-Arg group was (71.6±6.0)% at the 3rd day, which were significantly higher than (42.3±4.0)% in L-Arg group; the percentage of area of transformation was (45.6±5.4)%, which were significantly lower than (78.5±6.4)% in L-Arg group. Expression of Reg4 in pancreatic islets of STZ+L-Arg group was significantly lower than those in L-Arg group.ConclusionsSTZ impairs pancreatic β cells, aggravates pancreatic damage following L-arginine induced pancreatitis and inhibits pancreatic regeneration.

Acute pancreatitis; Pancreatic beta Cells; Pancreatic regeneration; Reg4

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.018

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金(09DZ1906904)；上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(09JC412100)

200072 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院 上海市第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科(胡國(guó)勇、趙嚴(yán)、沈杰、楊麗娟、熊杰、萬(wàn)榮、郭傳勇、王興鵬)

王興鵬，Email：wangxp1965@yahoo.com.cn