高道鍵 滿曉華 徐岷 張玉琦 高軍 龔燕芳 吳紅玉 金晶 許國銘 李兆申

·論著·

HDAC1基因沉默對人胰腺癌細胞PaTu8988細胞周期的影響

高道鍵 滿曉華 徐岷 張玉琦 高軍 龔燕芳 吳紅玉 金晶 許國銘 李兆申

目的探討組蛋白脫乙?；?(HDAC1)基因沉默對人胰腺癌PaTu8988細胞周期影響及可能機制。方法常規(guī)培養(yǎng)胰腺癌PaTu8988細胞，分為對照組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染 (c-siRNA)組及15、30 nmol/L HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染組。采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染細胞48 h后，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞HDAC1基因沉默效率及p21基因表達；流式細胞法檢測細胞周期的變化。結(jié)果與對照組比較，30 nmol/L HDAC1 siRNA組PaTu8988細胞的HDAC1蛋白表達明顯下降，p21蛋白表達明顯增加；G2/M期細胞比例顯著減少[(21.48±3.67)%比(28.28±2.94)%，P<0.05]，S期細胞比例顯著增加[(50.20±6.85)%比(32.49±2.78)%,P<0.05]。結(jié)論HDAC1 siRNA能特異、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988細胞HDAC1的表達，引起細胞S期阻滯，其機制可能與上調(diào)p21蛋白表達有關(guān)。

胰腺腫瘤； 組蛋白脫乙?；割悾?RNA干擾； 細胞周期

共同第一作者：滿曉華

組蛋白乙?；癄顟B(tài)由組蛋白乙酰基酶和組蛋白脫乙?；?histone deacetylase,HDACs)調(diào)節(jié)，組蛋白乙?；癄顟B(tài)的失衡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。腫瘤細胞HDAC 1高表達可明顯增強腫瘤細胞的增殖能力，并通過影響細胞外基質(zhì)而使腫瘤細胞移行和侵襲力明顯增強[2]。我們前期研究[3]結(jié)果顯示，HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染人胰腺癌PaTu8988細胞后能特異、有效地抑制細胞HDAC1表達，抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑可影響細胞周期，故本研究觀察HDAC1對胰腺癌細胞周期的調(diào)控作用及其機制。

材料和方法

一、細胞培養(yǎng)及分組

PaTu8988胰腺癌細胞系由德國Marburg市Philipps大學(xué)細胞生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所Elsasser博士惠贈，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期細胞，按1×105/孔接種于培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，分為對照組、對照siRNA(c-siRNA)組，HDAC1 siRNA 15、30 nmol/L組。每組3個復(fù)孔。對照組未予任何處理； c-siRNA組和HDAC1 siRNA 15、30 nmol/L組分別采用脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司)將30 nmol/L的c-siRNA或15、30 nmol/L的HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染PaTu8988細胞。HDAC1 siRNA和c-siRNA由美國Ambion公司設(shè)計和合成，HDAC1 siRNA正義鏈：5′-GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT-3′，反義鏈：5′-UACUUUGGACAUGACCGGCTT-3′。 轉(zhuǎn)染步驟參見美國Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染操作手冊，轉(zhuǎn)染6 h后更換成DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)48 h后消化，收集細胞。

二、HDAC1、p21蛋白檢測

提取各組細胞總蛋白，采用BCA 法行蛋白定量，取20 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測HDAC1、p21蛋白表達。兔抗人HDAC1多抗(sc-7872，Santa Cruz公司)工作濃度1∶1000；鼠p21單抗(AP021,碧云天公司)工作濃度1∶500；HRP標記羊抗兔二抗工作濃度1∶2000。最后ECL發(fā)光,X片曝光，暗室顯影、定影后掃描。以GAPDH作為內(nèi)參照。

三、細胞周期檢測

收集各組細胞，用預(yù)冷PBS洗后制成細胞懸液，加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。加入100 μg/ml的RNase 10 μl、50 μg/ml的碘化丙啶300 μl(晶美生物公司)，4℃避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測。具體步驟按晶美生物公司的操作手冊。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、PaTu8988細胞HDAC1、p21蛋白表達的變化

15、30 nmol/L HDAC1 siRNA組細胞HDAC1蛋白表達明顯低于對照組和c-siRNA組，30 nmol/L HDAC1 siRNA組表達量最低(圖1a)；而p21蛋白表達明顯高于對照組和c-siRNA組，30 nmol/L HDAC1 siRNA組的表達量最高(圖1b)。

1：對照組；2：c-siRNA組；3：15 nmol/L HDAC1 siRNA組；4：30 nmol/L HDAC1 siRNA組

圖1各組PaTu8988細胞HDAC1(a)和p21(b)蛋白的表達

二、PaTu8988細胞周期的變化

兩個HDAC1 siRNA組G2/M期細胞比例均顯著低于對照組和c-siRNA組，S期細胞比例均顯著高于對照組和c-siRNA組(P值均<0.05)；30 nmol/L HDAC1 siRNA組G0/G1期細胞比例顯著低于對照組(P<0.05，表1，圖2)。

表1 各組PaTu8988細胞的細胞周期比例

注：與對照組比較，aP<0.05；與c-siRNA 組比較，bP<0.05

a：對照組，b:c-siRNA組，c:15 nmol/L HDAC1 siRNA組，d:30 nmol/L HDAC1 siRNA組

圖2HDAC1 siRNA干擾對PaTu8988細胞周期的影響

討 論

許多研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1參與了胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。應(yīng)用HDAC抑制劑具有確切的抗增殖和抗腫瘤效果[4-5]。我們先前的研究也顯示抑制HDAC1表達后可抑制胰腺癌細胞增殖、誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡[3]。

腫瘤細胞增殖抑制和細胞凋亡都與細胞周期受阻密切相關(guān)，二者之間存在著復(fù)雜和精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。正常細胞往往因為生長周期失控，進而導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。不同細胞中HDACs的表達譜是不一樣的，所以去除相同的HDACs在不同的細胞株中可能產(chǎn)生的作用不同[6]。細胞周期是指細胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂終了的過程，其中最關(guān)鍵的是S期，此期細胞進行DNA倍增和染色體復(fù)制。本實驗結(jié)果顯示，HDAC1 siRNA瞬間轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞可使G2/M期細胞比例顯著降低，而S期細胞比例顯著增高， G0/G1期細胞比例亦有下降，提示沉默HDAC1基因可引起S期細胞周期阻滯，導(dǎo)致腫瘤細胞DNA倍增和染色體復(fù)制抑制，進而阻礙細胞分裂，實現(xiàn)對胰腺癌細胞增殖的抑制作用。

p21是最早被發(fā)現(xiàn)的細胞周期素依賴激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI)，CDKI通過與CDK復(fù)合物緊密結(jié)合，或與CDK直接結(jié)合，抑制細胞周期素與CDK結(jié)合而實現(xiàn)負調(diào)控作用。p21還可通過抑制CDK2/cyclin B激酶復(fù)合物的活性引起G2/M期阻滯[6]。HDAC抑制劑可以明顯上調(diào)p21的轉(zhuǎn)錄[7-8]。Lagger等[9]報道,HDAC 1一個重要的增殖相關(guān)功能就是抑制p21和p27的異常表達。本結(jié)果顯示，siRNA干擾HDAC1后細胞p21蛋白表達增加，提示沉默HDAC1基因是通過上調(diào)p21表達而影響細胞周期。

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[3] 高道鍵,徐岷,張玉琦,等.組蛋白去乙酰化酶1對人胰腺癌細胞增殖凋亡的影響. 中華消化雜志,2009,29:525-528.

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2010-11-29)

(本文編輯：屠振興)

Effectsofhistonedeacetylase1genesilencingoncellcycleregulationofpancreaticcancercelllinePaTu8988

GAODao-jian,MANXiao-hua,XUMin,ZHANGYu-qi,GAOJun,GONGYan-fang,WUHong-yu,JINJing,XUGou-ming,LIZhao-shen.

DepartmentofEndoscopy,EasternHepatobiliarySurgeryHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200438,China

LIZhao-shen,Email:lizhaoshench@gmail.com

ObjectiveTo investigate the effects of histone deacetylase 1 (HDAC1) gene silencing on cell cycle of pancreatic cancer cell line PaTu8988 and possible mechanism.MethodsThe PaTu8988 cells were routinely cultured and divided into control group, negative control siRNA group (c-siRNA), HDAC1 siRNA 15 nmol/L group and HDAC1 siRNA 30nmol/L group. After Liposomes 2000 transfection for 48 h, the Western blotting was used to detect the efficiency of HDAC1 gene silencing on protein levels and the expression of p21 protein. Cell cycle was evaluated by using flow cytometry.ResultsCompared with that of control group, the expression of HDAC1 protein in PaTu8988 cell of HDAC1 siRNA 30nmol/L group was significantly decreased, and the expression of p21 protein was significantly increased; the percentage of G2/M phase cells were significantly decreased [(21.48±3.67)%vs. (28.28±2.94) %,P<0.05]; while the percentage of S phase cells were significantly increased [(50.20±6.85)%vs. (32.49±2.78)%,P<0.05].ConclusionsHDAC1 siRNA can efficiently and specifically inhibit the expression of HDAC1 in PaTu8988 cells, and can induce S phase cells arrest, which may be related with up-regulation of p21 protein expression.

Pancreatic neoplasms; Histone deacetylases; RNA interference; Cell cycle

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.004

重大國際合作項目(30910103911)

200438 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院內(nèi)鏡科(高道鍵)；第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科(滿曉華、徐岷、張玉琦、高軍、龔燕芳、吳紅玉、金晶、許國銘、李兆申)

李兆申，Email: lizhaoshench@gmail.com