孫運良 徐燦 蘇長青 高軍 金晶 吳紅玉 李兆申

·論著·

CEA啟動子驅(qū)動下表達Hsp70基因的重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定

孫運良 徐燦 蘇長青 高軍 金晶 吳紅玉 李兆申

目的構(gòu)建癌胚抗原(CEA)啟動子驅(qū)動下靶向表達熱休克蛋白70(Hsp70)基因的重組腺病毒。方法通過RT-PCR和PCR的方法分別擴增人Hsp70基因和CEA啟動子，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC316-pCEA-Hsp70。將所得的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞獲得重組腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70。通過梯度離心純化病毒，采用半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量測定病毒滴度。分別以重組的腺病毒感染CEA陽性的人胰腺癌BxPC3細胞和CEA陰性的SW1990細胞，通過RT-PCR和ELISA法檢測Hsp70 mRNA和蛋白的表達。結(jié)果酶切和測序證實Hsp70基因和CEA啟動子成功插入PDC316質(zhì)粒。與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞獲得的病毒經(jīng)PCR擴增證實重組腺病毒構(gòu)建成功。最終獲得的病毒顆粒數(shù)達2.2×1011vp/ml，滴度為1.5×1010PFU/ml。重組腺病毒感染CEA陽性表達的BxPC3細胞后，可顯著增加Hsp70 mRNA和蛋白的表達，而感染CEA陰性的SW1990細胞，Hsp70 mRNA和蛋白的表達無變化。結(jié)論成功構(gòu)建了能夠在CEA陽性細胞中靶向表達Hsp70基因的重組腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70，為進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

重組，遺傳； 熱休克蛋白質(zhì)70； CEA啟動子； 腺病毒

近年來熱休克蛋白70(heat shock protein70，Hsp70)在免疫應(yīng)答中的作用引起人們的廣泛關(guān)注，其在機體的抗感染免疫、自身免疫，尤其是在腫瘤免疫中起重要作用[1]。研究證實，Hsp70可結(jié)合腫瘤細胞表達的多肽類抗原，通過內(nèi)源性途徑傳遞給主要組織相容性抗原復(fù)合物Ⅰ類分子，引發(fā)特異性的細胞毒性T細胞反應(yīng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強大的抗腫瘤免疫效應(yīng)[2-4]。因此，將攜帶Hsp70基因的載體導(dǎo)入腫瘤細胞，并在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，從而增強和誘導(dǎo)機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)已成為目前腫瘤免疫治療研究的熱點之一[5]。癌胚抗原(CEA)是最早被發(fā)現(xiàn)和鑒定的腫瘤相關(guān)抗原之一，在很多腺體腫瘤中均能大量表達。本研究構(gòu)建CEA基因啟動子驅(qū)動下表達Hsp70的重組腺病毒載體，以期在CEA陽性的腫瘤細胞中靶向性表達Hsp70，為進一步的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、人Hsp70基因和CEA啟動子的克隆

人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990、BxPC3、Capa-Ⅱ、CF為本實驗室保存。常規(guī)培養(yǎng)、收集PANC1細胞，提取總RNA。采用RT-PCR法擴增Hsp70基因，上游5′-CCCAAGCTTATGGCCAAAGCC-GCGGCG-3′，下游5′-GCGTCGACCTAATCTACCTCC-TCAATGGTGGG-3′，產(chǎn)物1826bp。同時提取健康志愿者外周血總RNA，RT-PCR法擴增人CEA啟動子(pCEA)序列(-299～+69)，上游5′-GAATTCCCCGGGACCCTGCTGGGTTTC-3′，下游5′-GCTTGA-GTTCCAGGAACGTTTTGGGATCC-3′，產(chǎn)物386 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠DNA回收試劑盒(QIAGEN公司)回收、純化擴增產(chǎn)物。通過T-A克隆，將純化的PCR產(chǎn)物分別插入pMD-18T質(zhì)粒(TaKaRa 公司)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，涂布含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)過夜，次日挑取單個菌落，在LB液體培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)過夜后，用質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司)提取質(zhì)粒DNA。用酶切法鑒定，并送上海invitrogen公司測序。正確插入的載體分別命名為T-Hsp70和T-pCEA。

二、腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

分別用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ雙酶切質(zhì)粒pDC316(Microbix Biosystems公司)和T-Hsp70，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌。提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后命名為pDC316-Hsp70。

分別用Xba I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒pDC316-Hsp70和T-pCEA，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌。提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定正確后命名為pDC316-pCEA-Hsp70。

三、重組腺病毒的包裝、鑒定和擴增

HEK293細胞購自Roche公司，常規(guī)培養(yǎng)。采用Lipofectamine2000將腺病毒骨架質(zhì)粒pBHG lox△E1、3Cre(Microbix Biosystems公司)和重組質(zhì)粒pDC316-pCEA-Hsp70共轉(zhuǎn)染至293細胞。轉(zhuǎn)染9～14 d后出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)3次病毒空斑純化，提取腺病毒DNA。應(yīng)用PCR法進行鑒定，陽性病毒命名為Ad5-pCEA-Hsp70。

將293細胞培養(yǎng)于75 cm2培養(yǎng)瓶，待細胞達到80%～90%融合時，加入適量病毒粗提液。培養(yǎng)3～4 d后離心收集細胞，加AD buffer保存液，-80℃至37℃凍融3次，離心收集上清。再反復(fù)感染293細胞，擴增病毒至所需要量。

采用CsCl 梯度離心法純化所得的病毒原液，應(yīng)用紫外分光光度計測定A260值，計算病毒顆粒數(shù)。采用半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(tissue culture infective dose, TCID50)測定病毒滴度。

四、胰腺癌細胞系CEA表達的檢測

將人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990、BxPC3、Capa-Ⅱ、CF分別以1×106個細胞接種于10 cm培養(yǎng)瓶。細胞貼壁后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液，以電化學(xué)發(fā)光法(試劑盒購自Roche公司)檢測培養(yǎng)液的CEA含量。以CEA陽性的結(jié)腸癌細胞株HT-29作為陽性對照，以單純培養(yǎng)液作為陰性對照。

五、Ad5-pCEA-Hsp70的Hsp70表達的鑒定

將CEA陽性的BxPC3和CEA陰性的SW1990細胞分別以1×105/孔接種于12孔板，以病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=10的Ad5-pCEA-Hsp70感染細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用RT-PCR和ELISA法(試劑盒購自StressGen公司)分別檢測Hsp70 mRNA和蛋白的表達。

結(jié) 果

一、Hsp70基因和CEA啟動子克隆的鑒定

Hsp70基因和pCEA的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別見約2000 bp、380 bp的單一條帶，與預(yù)期長度一致(圖1)；測序結(jié)果與GenBank中HSP70的全長編碼區(qū)序列(登錄號為NM_005345.5)、文獻報道的CEA啟動子序列[5]完全一致。

圖1Hsp70 (a)和CEA啟動子(b)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

二、腺病毒質(zhì)粒pDC316-pCEA-Hsp70的鑒定

pDC316-Hsp70質(zhì)粒分別經(jīng)HindⅢ、SalⅠ單酶切后電泳，均可見約5900 bp的單一條帶；經(jīng)HindⅢ和SalⅠ雙酶切后電泳，可見約3900 bp和2000 bp的2個條帶(圖2a)。

pDC316-pCEA-Hsp70分別經(jīng)Xba I和EcoR I單酶切后電泳，均可見約6000 bp的單一條帶；經(jīng)雙酶切后電泳，可見約5500 bp和500 bp的2個條帶(圖2b)。

M：Maker；1：未酶切；2：HindⅢ單酶切；3：SalⅠ單酶切；4：HindⅢ和SalⅠ雙酶切；1：Xba I單酶切；2：EcoR I單酶切；3：Xba I和EcoR I雙酶切

圖2pDC316-Hsp70(a)、pDC316-pCEA-Hsp70(b)酶切電泳圖

三、重組腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70鑒定和擴增

pBHG lox△E1、3Cre和pDC316-pCEA-Hsp70共轉(zhuǎn)染293細胞后形成的病毒經(jīng)抽提DNA、PCR擴增，產(chǎn)物電泳，顯示部分重組腺病毒(圖3的2、4泳道)能擴增出和陽性對照(6泳道)大小一致的Hsp70基因片段(5泳道)，為重組成功的腺病毒。凍融法擴增重組腺病毒后，病毒顆粒數(shù)達2.2×1011vp/ml，滴度為1.5×1010PFU/ml。

M：Maker；1：293細胞；2：pDC316-Hsp70；3～6：不同的重組腺病毒樣本

圖3重組腺病毒的PCR鑒定

四、不同胰腺癌細胞系的CEA分泌量檢測

PANC1、SW1990、Capa-Ⅱ細胞均不分泌CEA，而CF、BxPC3、HT-29均分泌CEA，1×106個細胞培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)上清的CEA含量分別為(2.1±0.4)、(37.2±3.5)、(2.8±0.6)ng/ml。

五、重組腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70靶向表達Hsp70的鑒定

取CEA陽性的BxPC3細胞和CEA陰性的SW1990細胞，經(jīng)重組腺病毒感染后，BxPC3細胞的Hsp70 mRNA表達增加(圖4)，培養(yǎng)上清中的Hsp70蛋白含量從(56.2±7.9)ng/ml增加到(401.1±36.9)ng/ml；而SW1990細胞的Hsp70 mRNA表達無變化(圖4)，培養(yǎng)上清中的Hsp70蛋白含量也無明顯變化[(50.3±8.9)ng/ml)比(63.1±10.2)ng/ml]。

1：BxPC3感染前；2：BxPC3感染后；3：SW1990感染前；4：SW1990感染后

圖4Ad5-pCEA-Hsp70感染前后細胞Hsp70 mRNA表達

討 論

腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中,由于腫瘤細胞的異質(zhì)性和基因多樣性，同時腫瘤抗原肽自身穩(wěn)定性差、易降解和低免疫原性等特點,常常逃避了機體免疫系統(tǒng)的識別，導(dǎo)致免疫耐受。研究表明，Hsp70不僅可作為抗原提呈的輔助分子參與腫瘤抗原肽的加工和處理，增強腫瘤抗原的穩(wěn)定性和免疫原性，而且可作為抗原提呈分子直接將腫瘤抗原肽提呈給T細胞，特別是細胞毒性T細胞，從而激發(fā)機體的抗腫瘤特異性免疫反應(yīng)[2-3,6]。Hsp70也可通過活化自然殺傷細胞及γ/δ T細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生非MHC限制的免疫應(yīng)答，并能活化補體系統(tǒng)，促進多種細胞因子的釋放，發(fā)揮抗腫瘤的作用[7-8]。此外，Hsp70可與樹突狀細胞(DCs)表面特異性受體結(jié)合，促進DCs的成熟，上調(diào)共刺激因子和MHC分子的表達，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性細胞毒T細胞和Th1反應(yīng)而發(fā)揮刺激宿主的免疫反應(yīng)[9-10]。由于Hsp70在機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，以Hsp70為基礎(chǔ)的腫瘤基因治療已成為近年來研究的熱點。

腺病毒載體具有宿主范圍廣泛和對人體的低致病性、病毒顆粒比較穩(wěn)定、基因組較少發(fā)生重排等優(yōu)點，是目前最常用的基因治療的載體之一。近年來，為了提高腺病毒介導(dǎo)基因治療的效率，人們利用腫瘤細胞與正常細胞之間的某些生物學(xué)性狀的差異，通過腫瘤細胞特異啟動子調(diào)控目的基因的表達，構(gòu)建了腫瘤靶向性重組腺病毒，如靶向肝癌的AFP啟動子、靶向前列腺癌的PSA啟動子等[11]。CEA在很多腺體腫瘤中大量表達，因此可作為腫瘤基因治療比較廣譜的分子靶標。多項研究表明，利用CEA啟動子調(diào)控外源基因的表達可獲得相對特異的腫瘤靶向作用，在提高腫瘤基因治療療效的同時，可控制基因表達的靶向性、降低其對正常細胞的毒副作用[12-13]。

本研究通過克隆人Hsp70基因和CEA啟動子，將Hsp70基因置于CEA啟動子控制之下，成功地構(gòu)建重組腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70。分別感染CEA陽性和陰性的腫瘤細胞系后，使重組腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70在CEA陽性的細胞中特異性地表達目的基因Hsp70，為進一步利用Hsp70進行腫瘤的靶向治療奠定了基礎(chǔ)。

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2011-01-14)

(本文編輯：呂芳萍)

Constructionandidentificationofrecombinantadenoviruscontainingheatshockprotein70genedrivenbycarcinoembryonicantigenpromoter

SUNYun-liang,XUCan,SUChang-qing,GAOJun,JINJing,WUHong-yu,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMiltaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo construct the recombinant adenovirus containing heat shock protein70 (Hsp70) gene driven by carcinoembryonic antigen (CEA) promoter.MethodsHsp70 gene and CEA promoter were amplified by RT-PCR and PCR, and then subcloned into the shuttle vector pDC316 to construct the recombinant vector PDC316-pCEA-Hsp70. The recombinant vector was co-transfected with adenoviral backbone plasmid into HEK293 cells to generate the recombinant adenovirus Ad5-pCEA-Hsp70. The recombinant adenovirus was purified by CsCl banding and titrated by 50% tissue culture infective dose (TCID50) assay. After transfection of the recombinant adenovirus into human pancreatic cell lines SW1990 and BxPC3, the expression of mRNA and protein level of Hsp70 were determined by RT-PCR and ELISA, respectively.ResultsDigestion and DNA sequencing certified that the Hsp70 gene and CEA promoter was successfully inserted into pDC316 plasmid. Virus acquired through co-transfection with backbone plasmid was confirmed to be constructed successfully by PCR amplification. The particles finally expressed was 2.2×1011vp/ml, and the titer was 1.5×1010PFU/ml. BxPC3 cancer cells with positive CEA expression showed increased expression of Hsp70 mRNA and protein after infected by recombinant adenovirus; while SW1990 cancer cells with negative CEA expression showed no change of expression of Hsp70 mRNA and protein after infected by recombinant adenovirus.ConclusionsThe recombinant adenovirus Ad5-pCEA-Hsp70 which can express Hsp70 gene in CEA positive cancer cells is constructed successfully.

Recombination,genetic; Heat shock protein 70; CEA promoter; Adenoviruses

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.007

國家青年科學(xué)基金(30801106)

210043 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科(孫運良、徐燦、高軍、金晶、吳紅玉、李兆申)；第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院分子腫瘤研究室(蘇長青)

李兆申，Email：zhsli@81890.net