周淑群 李明艷 周定球

HPLC法測定健肝顆粒中綿茵陳成分綠原酸的含量

周淑群 李明艷 周定球

目的 建立健肝顆粒中綠原酸的含量測定方法。方法 采用高效液相色譜法,色譜條件：Diamonsil-C18柱 (250 mm ×4.6 mm,5um);流動(dòng)相為乙腈 -0.4磷酸溶液 (20：80);流速 0.8 ml/min;檢測波長 336nm;柱溫 30℃。結(jié)果 綠原酸在 9.03～180.6ug/ml范圍內(nèi),其峰面積值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系,r=0.9995,平均加樣回收率為 99.7%,RSD為 0.71%。結(jié)論 該測定方法快速簡便,重現(xiàn)性好,可用于健肝顆粒的質(zhì)量控制。

健肝顆粒;綠原酸;HPLC

健肝顆粒是由甘草、黃花母、蝦鉗草、黃鱔藤、田基黃、綿茵陳,六味中藥制成的制劑,用于治療急、慢性肝炎。為了有效控制該制劑的質(zhì)量,本文參照有關(guān)文獻(xiàn)[1,2],建立高效液相色譜法測定其中綠原酸含量的方法,結(jié)果顯示該方法簡便,精密度好,重復(fù)性好,可用于本制劑的質(zhì)量控制。現(xiàn)介紹如下。

1 儀器和試藥

日本島津 LC-10AT高效液相色譜儀,SPD-10A檢測器,CLASS-VP 6.12 SPI色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng),UV-24010PC紫外分光光度計(jì)(日本島津),北京賽多利斯 BP211D電子分析天平,0412-1離心機(jī),B2500S-MT超聲波清洗機(jī)。綠原酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào)：110753-200413)乙腈、甲醇均為色譜純,水為注射用水。健肝顆粒劑由本院生產(chǎn) (批號(hào) ：110104,110107,110112)。

2 處方與制備

取甘草 25 g,黃花母 100 g,蝦鉗草 100 g,黃鱔藤 100 g,田基黃 100 g,綿茵陳 100 g,尼泊金 0.5 g,總制成 100 g。將上述藥材加水浸泡 24 h,煎煮兩次,每次 1 h,除藥渣后濃縮成流浸膏 (相對(duì)密度 1.2),加蔗糖粉 (過 40目篩),制軟材、制粒、干燥、整粒,即得。

圖 1 健肝顆粒的 HPLC圖

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18柱 (250 mm×4.6 mm,5um),流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液 (20∶80),流速 0.8 ml/min,檢測波長 336nm,柱溫 30℃,進(jìn)樣量 20μl。在此色譜條件下,添加劑無干擾。色譜圖見圖 1。由圖可見,在此色譜條件下,綠原酸的保留時(shí)間為 7.9 min出峰良好,無干擾。

3.2 溶液的制備

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 精密稱取綠原酸對(duì)照品適量,加 50%甲醇溶解、稀釋、定容,制成 1.806 mg/ml的儲(chǔ)備液。

3.2.2 供試品溶液 取供試品約 1 g,研成細(xì)粉,精密稱定,置 25 ml棕色容量瓶中,加 50%甲醇定容,搖勻,超聲 30 min后取出,放至室溫,定容,搖勻,取 5 ml離心,取上清液用針式過濾器過濾,進(jìn)樣。

3.2.3 陰性樣品溶液 除綿茵陳外,其余各藥按處方比例依工藝制成陰性樣品,再按供試品溶液制備方法,制得陰性供試品溶液。

3.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液,在上述色譜條件下進(jìn)樣,記錄色譜圖,結(jié)果綠原酸色譜峰與其他雜質(zhì)峰得到較好的分離,分離度均大于1.5,陰性對(duì)照無干擾,色譜圖見圖 1。

3.4 線性關(guān)系

分別精密量取綠原酸對(duì)照品貯備液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置 10 ml容量瓶中 ,用甲醇稀釋到刻度線制成對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣,以濃度為橫坐標(biāo) (X),峰面積為縱坐標(biāo) (Y),進(jìn)行線性回歸,得綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=70900x+62527(n=6,r=0.9995),線性范圍是 9.03～180.6ug。

3.5 回收率試驗(yàn)

取 6份已知含量的樣品適量,加入一定含量的對(duì)照品溶液,按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下處理,在上述色譜條件下,測定加樣回收供試品溶液中綠原酸的含量。計(jì)算綠原酸加回收率,結(jié)果見表 1。

表 1 綠原酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

3.6 精密度試驗(yàn)

取一份中間濃度的對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣 6次,測得綠原酸的峰面積 RSD為 0.74%。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一份樣品,按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備,分別在 0,1,2,3,4,5 h依法測定,記錄色譜峰的峰面積,綠原酸的 RSD為 0.27%。表明供試品溶液在 5 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品 6份,分別按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備,測定峰面積,計(jì)算含量,綠原酸的 RSD為1.96%,結(jié)果表明重復(fù)性良好。

3.9 樣品含量測定

取三份樣品,分別按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作,測得其中綠原酸含量分別為 0.4061 mg/g、0.4056 mg/g、0.4059 mg/g。

4 討論

4.1 本法根據(jù)健肝顆粒中綿茵陳成分綠原酸的紫外光譜選定 336 nm作為測定波長;而選用乙腈-0.4%磷酸溶液 (20：80)作為流動(dòng)相,可使基線更加平穩(wěn),在 7.9 min出峰,峰形好,分離效果也好在選定的色譜條件下,可排除其他成分的干擾。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇與樣品溶液體積比為 5：5進(jìn)行提取綠原酸,獲得較好的效果。本法用于檢測健肝顆粒中綿茵陳成分綠原酸的含量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

4.2 健肝顆粒由中藥綿茵陳、田基黃、甘草等組成,該方具有清熱利濕、散瘀消腫之功效,用于急慢性肝炎,尤其對(duì)病毒性肝炎有特殊療效。綿茵陳是方中君藥。綠原酸是綿茵陳的主要活性成分之一,具有利膽、抗菌、清除自由基、抗氧化等多種藥理作用[2]。綠原酸抗氧化機(jī)理為其分子的酚羥基與有害自由基反應(yīng)變成較穩(wěn)定的半醌式自由基,從而終止有害自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。同時(shí),綠原酸也能通過自身的還原性質(zhì)直接給電子消耗掉有害自由基[3]。由于影響中成藥制劑有效成分含量的因素較多,例如不同產(chǎn)地,不同采集時(shí)間得到的中藥材其活性成分相差較大,制備工藝中溫濕度、液體用量、提取時(shí)間等對(duì)制劑質(zhì)量均有一定的影響,因此,檢測制劑中有效成分的含量以保證療效是十分必要和可行的。

[1] 李忠.高效液相色譜法測定病毒清顆粒中綠原酸的含量.中國藥師 ,2005,5(8)：393-394.

[2] 任榮,李正翔,李彬,等.HPLC法測定涼血化斑顆粒劑中綠原酸的含量.中國醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)和分析,2007,7(6)：441-443.

[3] 童珊珊,徐亞萍,金花,等.綿茵陳提取液中綠原酸的測定及其抗氧化活性研究.江蘇中醫(yī)藥,2009,41(4)：57-59.

545005廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院