高宏 贠亞波 兀江波 曹霞萍

AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)甘草提取液的最佳動(dòng)態(tài)純化條件

高宏 贠亞波 兀江波 曹霞萍

為優(yōu)選出AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)甘草酸的最佳動(dòng)態(tài)吸附及解吸條件。我們采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)甘草提取物的最佳動(dòng)態(tài)吸附工藝，采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選解吸純化的最佳工藝進(jìn)行綜合分析。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的直觀分析和方差分析得出上柱藥液濃度對(duì)吸附量有顯著影響，最佳上樣條件為A3B1C2，即上柱液濃度為0.5 g/ml，徑高比為1∶8，流速為2 ml/min為最佳上樣條件，采用30%的乙醇洗脫雜質(zhì)，采用80%的乙醇富集甘草酸。

甘草;甘草酸;正交實(shí)驗(yàn);AB-8大孔吸附樹(shù)脂

甘草為豆科植物甘草的干燥根和根莖。具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的作用;用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性［1］。甘草中含有的主要有效成分為甘草苷、甘草酸等。大孔吸附樹(shù)脂是20世紀(jì)60年代末在離子交換劑和其他吸附劑應(yīng)用的基礎(chǔ)上，人工合成的一種新型多孔性高分子聚合物。其巨大的比表面積使其具有良好的吸附性能，可以通過(guò)物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物質(zhì)，從而達(dá)到分離提純的目的。在甘草的有效成分中，甘草酸與甘草酸的含量較多。本實(shí)驗(yàn)采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)從甘草中提取的甘草酸進(jìn)行進(jìn)一步純化研究。

1 儀器與試藥

儀器：美國(guó)惠普HP1100型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，HP1100/WIND3D化學(xué)工作站;AE-240電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。試藥：甘草酸單銨鹽對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110731-200513);甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純;AB-8型((南開(kāi)大學(xué)化工廠);甘草購(gòu)自亳州永剛藥材總公司，粉碎(過(guò)80目篩)，備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 甘草酸含量測(cè)定方法色譜分析條件色譜柱：HP hypersiL C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫為 30℃;流動(dòng)相為甲醇-0.2 mol/ml醋酸按-0.1%醋酸(60∶40∶0.1);檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm;流速0.8 ml/min;進(jìn)樣體積10 μl。對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 甘草酸單銨標(biāo)準(zhǔn)品圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取甘草酸單銨鹽對(duì)照品5 mg，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備 稱(chēng)取已粉碎的粗粉甘草，置玻璃層析柱中，加入5倍量的0.5%氨水浸泡6 h后，開(kāi)始滲漉，收集滲漉液12倍量后，停止?jié)B漉，濃縮滲漉液，以備上樣。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 樹(shù)脂預(yù)處理 乙醇濕法裝柱，用乙醇在柱上流動(dòng)清洗，不時(shí)檢查流出的乙醇液，至乙醇液與水混合(1：5)不呈白色渾濁為止，然后以大量蒸餾水洗去乙醇至無(wú)醇昧。再用2BV的5%HCL溶液，以4～6 BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層并浸泡2～4 h，再用蒸餾水以同樣流速洗至出水pH呈中性，然后用2 BV的2%NaOH溶液，以4～6 BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡2～4 h，最后用蒸餾水以同樣流速洗至出水pH值呈中性，樹(shù)脂保存在層析柱中備用，

3.2 動(dòng)態(tài)吸附 為考察上柱條件對(duì)樹(shù)脂吸附的影響，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定上柱樹(shù)脂體積50 ml，以徑高比、上樣濃度、流速作為考察因素，建立L9(34)正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)安排見(jiàn)表1、2。以甘草酸到達(dá)泄漏點(diǎn)(流出液中目的產(chǎn)物的質(zhì)量濃度達(dá)到進(jìn)樣質(zhì)量濃度的5%時(shí)，即為吸附終點(diǎn)，達(dá)到吸附終點(diǎn)時(shí)得流出液體積定義為泄漏點(diǎn)［2］)時(shí)，樹(shù)脂柱對(duì)甘草酸的吸附總量作為測(cè)評(píng)指標(biāo)，確定最佳上樣條件。具體操作：按照正交表安排，選定符合規(guī)格的層析柱，取AB-8大孔吸附樹(shù)脂50 ml濕法裝柱，按照正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)。每10 ml收集一瓶，標(biāo)號(hào)，每瓶取1 ml，稀釋至5 ml，過(guò)濾，測(cè)定收集液中甘草酸的濃度，出現(xiàn)泄漏點(diǎn)時(shí)停止上樣。結(jié)果見(jiàn)表1、2、3。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

4 討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出最佳的動(dòng)態(tài)吸附條件，同時(shí)采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳解吸條件，不僅提高甘草酸的收率，同時(shí)純度也有所提高。

4.2 本實(shí)驗(yàn)中利用了不同濃度的乙醇洗脫物質(zhì)的不同，采用低濃度洗脫雜質(zhì)，高濃度洗脫有效成分，使得有效部位的提取成為可能。為中藥有效成份、有效部位的提取、純化、分離及中藥復(fù)方藥物的生產(chǎn)研究的進(jìn)步起到很大的促進(jìn)作用。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.化學(xué)工業(yè)出版社，2010：80.

［2］陳順，關(guān)延彬.大孔樹(shù)脂吸附骨碎補(bǔ)總黃酮特性的研究.中國(guó)中藥雜志，2007，32(8)：750-752.

472000 河南省三門(mén)峽市中醫(yī)院

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

注：F0.05(2.2)=19.0

因素 SS f F F0.05顯著性A 109998.96 2 21.841 19.00＊＊B 34877.097 2 6.925 19.00 C 1588.281 2 1.000 19.00 5036.44 2 0.522 19.00 D(誤差)

通過(guò)對(duì)以上數(shù)據(jù)的直觀分析和方差分析可以看出，影響吸附量的因素主次順序?yàn)?A＞B＞C，最佳上樣條件為A3B1C2D2，即當(dāng)上樣濃度為18 mg/ml，徑高比為1∶8，流速為2 ml/min為最佳上樣條件。按照最優(yōu)條件重復(fù)上樣3次，計(jì)算對(duì)甘草酸的吸附量。結(jié)果如表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

709.15 702.65 710.46 1 2 3甘草酸吸附量(mg)實(shí)驗(yàn)編號(hào)

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，優(yōu)選出的吸附工藝穩(wěn)定可靠。由此可以計(jì)算出1 ml水飽和的AB-8大孔吸附樹(shù)脂可以吸附14.15 mg甘草酸。

3.3 動(dòng)態(tài)解吸 按照動(dòng)態(tài)吸附的最佳條件準(zhǔn)備7根已達(dá)達(dá)最大上樣量的柱子，先用蒸餾水2 ml/min洗脫至洗脫液無(wú)色，然后分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%以2 ml/min的速度，每25 ml收集為一瓶，過(guò)濾后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)洗脫液中甘草酸的濃度，繪制動(dòng)態(tài)解吸圖。見(jiàn)圖2。

圖2 動(dòng)態(tài)解吸圖

由圖表可知，20%、30%的乙醇洗脫出來(lái)的甘草酸的濃度很小，洗脫液顏色由深變淺在75～150 ml時(shí)顏色變化不明顯，說(shuō)明低濃度的乙醇可以洗脫大量的雜質(zhì);而80%的乙醇解吸較快且洗脫劑用量較少，在175 ml時(shí)已經(jīng)將甘草酸完全洗脫下來(lái)。綜合考慮，確定動(dòng)態(tài)解吸先用水洗脫至無(wú)色后，用30%的乙醇75 ml洗脫雜質(zhì)，然后用150 ml80%乙醇洗脫有效成分。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照最佳動(dòng)態(tài)吸附條件和最佳解吸條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 純化驗(yàn)證試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)編號(hào) 收率 轉(zhuǎn)移率 純度1 3.25% 77% 69.13%2 3.18% 78% 69.16%3 3.50% 78% 68.69%