任麗楠 郭曉鐘 鄒德莉 劉峰

·論著·

內(nèi)分泌腺來源的血管內(nèi)皮生長因子抑制胰腺癌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究

任麗楠 郭曉鐘 鄒德莉 劉峰

目的探討內(nèi)分泌腺來源的血管內(nèi)皮生長因子(EG-VEGF)在胰腺癌MiaPaCa細(xì)胞中抗凋亡作用及其相關(guān)分子機制。方法以50、100、200 ng/ml EG-VEGF處理細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞p42/44MAPK、STAT3蛋白表達及其磷酸化，檢測抗凋亡蛋白Mcl-1的表達。應(yīng)用G蛋白耦聯(lián)非特異受體阻斷劑PTX、Rsa/ERK信號通路阻斷劑PD98059和JAK/STAT3信號通路阻斷劑AG490預(yù)處理細(xì)胞1 h，觀察Mcl-1蛋白表達的變化。結(jié)果100 ng/ml EG-VEGF可使MiaPaCa細(xì)胞的凋亡率從(28.4±4.6)%顯著下降到(13.2±2.5)%(P<0.05)。50 ng/ml的EG-VEGF處理后，MiaPaCaⅡ細(xì)胞p42/44MAPK的磷酸化增加(1.735±0.019)倍；STAT3的磷酸化增加(21.810±0.052)倍，均較對照組顯著增加(P值均<0.05),但100、200 ng/ml EG-VEGF沒有進一步增加蛋白的磷酸化。50 ng/ml的EG-VEGF處理后，Mcl-1蛋白的表達較對照組增加(3.460±0.002)倍，但100、200 ng/ml EG-VEGF沒有進一步增加蛋白的表達；應(yīng)用PTX預(yù)處理后，Mcl-1蛋白表達的增加被完全抑制，用PD98059、AG490預(yù)處理后Mcl-1表達增加抑制率分別為52%和68%。結(jié)論EG-VEGF可抑制MiaPaCa細(xì)胞的凋亡，其機制可能與激活Ras-MAPK和JAK-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及增加Mcl-1蛋白的表達有關(guān)。

胰腺腫瘤； 血管內(nèi)皮生長因子； 細(xì)胞凋亡； 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

內(nèi)分泌腺來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(endocrine glands-derived vascular endothelial growth factor，EG-VEGF，又稱 PK1)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有組織特異性的血管內(nèi)皮生長因子。它可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，但對胰腺癌的調(diào)控作用目前尚無文獻報道。本實驗旨在觀察EG-VEGF對人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa Ⅱ細(xì)胞凋亡的影響，探討其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制。

材料和方法

一、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

人胰腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MiaPaCa Ⅱ由瑞士伯爾尼大學(xué)Friess博士惠贈。細(xì)胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基換成無血清DMEM培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)上清中加入終濃度為100 ng/ml的重組人EG-VEGF(Peprotech公司)，對照組上清不加EG-VEGF，每組設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入AnnexinⅤ-PI(BD PharMingen)染色，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

二、蛋白質(zhì)印跡法檢測p42/44MAPK、磷酸化p42/44MAPK (P-p42/44MAPK)、STAT3、P-STAT3及Mcl-1蛋白表達

MiaPaCa Ⅱ細(xì)胞貼壁后用無血清DMEM培養(yǎng)過夜的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入終濃度為50、100、200 ng/ml的EG-VEGF，以不加EG-VEGF細(xì)胞作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)20 min。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測p42/44MAPK、P-p42/44MAPK、STAT3、P-STAT-3蛋白表達。鼠抗人p42/44MAPK、P-p42/44MAPK、STAT3、P-STAT-3一抗(均購自Cell Signaling公司)以及內(nèi)參抗β-actin一抗(Santa Cruz Biotechnology公司)均1∶1000稀釋；鼠抗人Mcl-1(R&D Systems公司)一抗以1∶500稀釋；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中山生物有限公司)1∶5000稀釋。最后ECL發(fā)光，圖像掃描儀掃描。以目的條帶與β-actin條帶灰度比值表示蛋白相對表達量。以對照組的磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白比值作為1，計算實驗組的磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白比值的增加倍數(shù)。

此外，在無血清DMEM培養(yǎng)過夜的MiaPaCaⅡ細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入G蛋白耦聯(lián)非特異受體阻斷劑PTX(終濃度為 200 ng/ml，公司)、Rsa/ERK信號通路阻斷劑PD98059(終濃度為50 μmol/L)和JAK/STAT3信號通路阻斷劑AG490 (終濃度為100 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h，以單加DMSO為DMSO組。隨后吸盡培養(yǎng)上清，加入終濃度為100 ng/ml EG-VEGF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，以不加EG-VEGF為對照組。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測處理前后細(xì)胞的Mcl-1蛋白表達。以目的條帶與β-actin條帶灰度比值表示蛋白的相對表達量，以對照組為1，計算實驗組Mcl-1蛋白表達的增加倍數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件包，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EG-VEGF對MiaPaCaⅡ細(xì)胞凋亡的影響

AnnexinⅤ-PI染色后，單綠色著色為早期凋亡細(xì)胞，單紅色為晚期凋亡細(xì)胞，紅色和綠色共同著色為凋亡中期細(xì)胞(圖1)。對照組的細(xì)胞凋亡率為(28.4±4.6)%，100 ng/ml EG-VEGF處理組的細(xì)胞凋亡率為(13.2±2.5)%，較對照組顯著降低(P<0.05)。

圖1 MiaPaCaⅡ細(xì)胞的凋亡狀況(AnnexinⅤ-PI染色)

二、EG-VEGF對細(xì)胞p42/44MAPK、STAT3磷酸化的影響

50、100、200 ng/ml的EG-VEGF處理后，MiaPaCaⅡ細(xì)胞p42/44MAPK的磷酸化分別增加(1.735±0.019)、(1.943±0.022)、(1.930±0.054)倍； STAT3的磷酸化分別增加(21.810±0.052)、(28.850±0.048)、(28.870±0.054)倍(圖2a、b)，但各濃度間增加磷酸化的程度無顯著差異。

三、EG-VEGF對細(xì)胞Mcl-1 蛋白表達的影響

50、100、200 ng/ml的EG-VEGF處理后，MiaPaCaⅡ細(xì)胞Mcl-1的表達量較對照組分別增加(3.460±0.002)、(3.900±0.002)、(3.940±0.003)倍(圖2c)。但各濃度間表達的增加程度無顯著差異。

圖2不同濃度EG-VEGF對細(xì)胞p42/44MAPK(a)、STAT3(b)磷酸化及Mcl-1蛋白表達(c)的影響

四、相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑對細(xì)胞Mcl-1表達的影響

DMSO組、PTX組、PD98059組、AG490組的Mcl-1蛋白表達量較對照組分別增加(2.320±0.005)、(0.940±0.003)、(1.870±0.006)、(1.250±0.005)倍。PTX完全阻斷EG-VEGF對Mcl-1表達的增強作用，而PD98059及AG490阻斷EG-VEGF對Mcl-1表達的增強作用分別為52%和68%(圖3)。

圖3 相關(guān)信號通號阻斷劑對Mcl-1蛋白表達的影響

討 論

EG-VEGF(PK1)是2001年被確認(rèn)的組織特異性的血管內(nèi)皮生長因子[1]，僅僅作用于生成類固醇組織的細(xì)胞。它有兩個G蛋白耦聯(lián)受體PKR1和PKR2[2]，與受體結(jié)合后激活絲裂酶原活化蛋白酶p42/44和磷脂酰肌醇3-激酶信號通路，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和存活[3]。但對其調(diào)控胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用及機制目前尚無相關(guān)報道。

本結(jié)果顯示， EG-VEGF能抑制MiaPaCa Ⅱ細(xì)胞的凋亡，可促進p42/44MAPK的磷酸化，激活Ras-MAPK信號通路，與文獻報道相一致[3-4]。同時，本結(jié)果顯示，EG-VEGF可促進STAT3的磷酸化，激活JAK-STAT3信號通路。有關(guān)研究尚未見有類似的報道。

Mcl-1是Bcl-2家族中重要的抗凋亡蛋白，在胰腺癌凋亡的過程中扮演重要作用[5]。本結(jié)果顯示，一定劑量的EG-VEGF可促進Mcl-1的表達，應(yīng)用PTX可相對完全地阻斷EG-VEGF對Mcl-1的調(diào)控作用，這是因為PTX阻斷了EG-VEGF與受體的結(jié)合所致[6]。這一結(jié)果一方面提示EG-VEGF對Mcl-1的調(diào)控關(guān)系，另一方面也反映其可在胰腺癌細(xì)胞中激活相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)抗凋亡蛋白的表達。由于EG-VEGF的組織特異性，故其在胰腺癌的研究中有可能成為診斷和治療的新靶點。

[1] LeCouter J, Kowalski J, Foster J, et al. Identification of an angiogenic mitogen selective for endocrine gland endothelium. Nature, 2001,412:877-884.

[2] Lecouter J, Ferrara N.EG-VEGF and Bv8. A novel family of tissue-selectivemediators of angiogenesis, endothelial phenotype and function. Trends Cardiovas Med,2003, 13: 276-282.

[3] Kisliouk T, Podlovni H, Spanel BK. Prokineticins (endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor and BV8) in the bovine ovary: expression and role as mitogens and survival factors for corpus luteum-derived endothelial cells. Endocrinology, 2005, 146: 3950-3958.

[4] Lin R, LeCouter J, Kowalski J, et al. Characterization of endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor signaling in adrenal cortex capillary endothelial cells. J Biol Chem,2002,277:8724-8729.

[5] Akgul C, Turner PC, White MR, et al. Functional analysis of the human MCL-1 gene. Cell Mol Life Sci,2000, 57: 684-691.

[6] Lin DC,Bullock CM,Ehiert FJ,et al.Identification and molecular characterization of two closely related G protein-coupled receptors activated by prokineticins/endocrine gland vascular endothelial growth factor. J Biol Chem,2002, 277: 19276-19280.

2010-11-02)

(本文編輯：屠振興)

InvestigationofthesignaltransductioninEG-VEGFinhibitingpancreaticcancercellsfromapoptosis

RENLi-nan,GUOXiao-zhong,ZOUDe-li,LIUFeng.

GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommend,Shenyang110840,China

Correspondingauthor:GUOXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the anti-apoptosis effects of EG-VEGF on pancreatic cancer cell MiaPaCa and its molecular mechanism.MethodsThe cells were treated with 50, 100, 200 ng/ml EG-VEGF. Flow cytometry was used to determine the apoptosis. The expression of p42/44MAPK, STAT3 protein and the phosphorylation, and anti-apoptosis protein Mcl-1 was evaluated by Western blot. Non-specific G protein-coupled receptor antagonist PTX, Rsa/ERK signal transduction blockade PD98059, JAK/STAT3 signal transduction blockade AG490 were used to treat the cells for 1 h, and the change of Mcl-1 protein was observed.ResultsAfter treated with 50 ng/ml EG-VEGF, the apoptosis rate of MiaPaCa was decreased from (28.4±4.6)% to (13.21±4.65)% (P<0.05); the phosphorylation of p42/44MAPK increased by 1.735±0.019 folds; the phosphorylation of STAT3 increased by 21.810±0.052 folds; the expression of Mcl-1 protein increased by 3.460±0.002 folds when compared with that of control group,and the difference was statistically significant (P<0.05). But the degree of phosphorylation and the expression of Mcl-1 were not further increased with 100, 200 ng/ml EG VEGF treatment. After PTX pre-treatment, the increase of Mcl-1 protein expression was completely inhibited, and after PD98059, AG490 pre-treatment, the increase of Mcl-1 expression was inhibited to 52% and 68%.ConclusionsEG-VEGF can inhibit MiaPaCa cell from apoptosis, and the mechanism may be related with activation of Ras MAPK and JAK STAT3 signal transduction pathway and up-regulation of Mcl-1.

Pancreatic neoplasm; Vascular endothelial growth factor; Apoptosis; Signal transduction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.015

110840 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科

郭曉鐘，Email:guoxiaozhong1962@163.com