江靜嫻 張敏敏 楊驊 吳洪玉 鄒多武 李兆申

·論著·

CⅡTA基因調(diào)控胰腺腫瘤細(xì)胞MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)的體外研究

江靜嫻 張敏敏 楊驊 吳洪玉 鄒多武 李兆申

目的研究CⅡTA基因?qū)θ艘认侔〤aPanC-2細(xì)胞和小鼠胰腺癌PanC-02細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)的影響。方法將攜帶CⅡTA基因的腺病毒(Ad-CⅡTA)分別感染人胰腺癌CaPanC-2細(xì)胞和小鼠胰腺癌PanC-02細(xì)胞，培養(yǎng)24、48、72 h。實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)感染細(xì)胞CⅡTA mRNA的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CⅡTA蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MHCⅡ類(lèi)分子陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分比。結(jié)果CaPanC-2細(xì)胞感染后24、48、72 h的CⅡTA mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的(16769±6455)、(261568±348850)和(834816±97783)倍(P<0.05)；PanC-02細(xì)胞為對(duì)照組的(548546±87755)、(1242684±624888)和(1401647±726145)倍(P<0.05)。CaPanC-2和PanC-02細(xì)胞均不表達(dá)CⅡTA蛋白，感染后48 h，CaPanC-2、PanC-02細(xì)胞CⅡTA蛋白表達(dá)量為0.746±0.499和0.631±0.244。感染24、48、72 h組CaPanC-2細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的細(xì)胞百分比分別為(8.1±0.3)%、(18.9±0.3)%、(78.5±0.9)%，顯著高于對(duì)照組的(7.0±0.1)%(P<0.01)；PanC-02細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的細(xì)胞百分比分別為(5.1±0.2)%、(37.3±2.0)%、(68.8±2.2)%，顯著高于對(duì)照組的(2.2±0.2)%(P<0.01)。結(jié)論Ad-CⅡTA體外感染胰腺腫瘤細(xì)胞可促進(jìn)CⅡTA基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞表面MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)。

胰腺腫瘤； 主要組織相容性復(fù)合物； 腺病毒； 感染

主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)分為組成型和誘導(dǎo)型，其表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平[1]。MHCⅡ類(lèi)反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator,CⅡTA)是MHCⅡ類(lèi)基因表達(dá)的“分子開(kāi)關(guān)”，其對(duì)MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)調(diào)控有著專(zhuān)一性和有效性[2]。外源性CⅡTA能夠促進(jìn)MHCⅡ類(lèi)基因轉(zhuǎn)錄的激活[3]，改變MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤的免疫原性及T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞抗原的遞呈，從而達(dá)到激活機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[4]。為此，我們利用構(gòu)建好的重組腺病毒載體Ad-CⅡTA體外感染胰腺癌細(xì)胞株CaPanC-2和PanC-02，證實(shí)通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的外源性CⅡTA基因能夠促進(jìn)MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)，為胰腺癌的腫瘤免疫治療提供了新的途徑和啟示。

材料和方法

一、腺病毒Ad-CⅡTA感染胰腺癌細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞株CaPanC-2和小鼠胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anC-02為本實(shí)驗(yàn)室保存。攜帶CⅡTA基因的腺病毒(Ad-CⅡTA)為本實(shí)驗(yàn)室先期制備。細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，加入含IFN-γ 500 U/ml(Peprotech公司)的培養(yǎng)基常規(guī)孵育48 h，換不含血清的opti-MEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞4 h，加入Ad-CⅡTA轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞株，病毒量為100 MOI，8 h后更換為正常的含10%小牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察呈現(xiàn)綠色熒光的感染細(xì)胞。

二、實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)感染細(xì)胞CⅡTA mRNA表達(dá)

收集感染的細(xì)胞，應(yīng)用Trizol裂解液(Takara公司)抽提細(xì)胞總RNA。引物序列：小鼠CⅡTA上游5′-AAGCAGGACAGAAGCCTCAGAA-3′，下游5′-GCTTCCTGTGCTTGAGTCCAT-3′，擴(kuò)增片段369 bp；小鼠內(nèi)參GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，擴(kuò)增片段233 bp；人CⅡTA上游5′-ACGCTT-TCTGGCTGGATTAGT-3′，下游5′-TCAACGCCA-GTCTGACGAAGG-3′，擴(kuò)增片段342 bp；人內(nèi)參GAPDH上游5′-TGACCCTGAAGTACCCCATTG-3′，下游5′-TCAGGATCTTCATGAGGTAG-3′，片段387 bp。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR試劑均購(gòu)自Takara公司。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量2-△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)倍數(shù)?！鰿t值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；△△Ct值=目的基因△Ct值-內(nèi)參基因△Ct值；以對(duì)照組表達(dá)量為1，2-△△Ct值即為目的基因的表達(dá)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取均值。

三、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)感染細(xì)胞CⅡTA蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞后加入蛋白裂解液(Thermo公司)提取蛋白，取30 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CⅡTA蛋白表達(dá)。小鼠抗人、兔抗小鼠CⅡTA單抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記山羊抗鼠、山羊抗兔為上海博邁公司產(chǎn)品。以β-actin作為內(nèi)參。最后ECL顯影，圖像分析儀掃描，以目的條帶與β-actin條帶灰度值比作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染細(xì)胞MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)

收集對(duì)照組和感染后24、48、72 h的細(xì)胞，PBS洗滌后加入熒光蛋白GFP標(biāo)記的抗馬MHC Ⅱ類(lèi)(I-A/I-E)PE或抗人HLA-DR PE(eBioscience公司)孵育15 min進(jìn)行標(biāo)記，用PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、細(xì)胞感染后CⅡTA mRNA表達(dá)的變化

Ad-CⅡTA感染后24、48、72 h，CaPanC-2細(xì)胞CⅡTA mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性明顯上調(diào)，分別為對(duì)照組的(16769±6455)、(261568±348850)和(834816±97783)倍(P<0.05)；PanC-02細(xì)胞CⅡTA mRNA表達(dá)亦呈時(shí)間依賴(lài)性明顯上調(diào)，分別為對(duì)照組的(548546±87755)、(1242684±624888)和(1401647±726145)倍(P<0.05)。

二、細(xì)胞感染后CⅡTA蛋白表達(dá)的變化

CaPanC-2和PanC-02細(xì)胞均不表達(dá)CⅡTA蛋白。感染后48 h，CaPanC-2細(xì)胞CⅡTA蛋白表達(dá)量為0.746±0.499；PanC-02細(xì)胞的表達(dá)量為0.631±0.244(圖1)。

1：CaPanC-2細(xì)胞的空白對(duì)照；2：腺病毒感染的CaPanC-2；3：PanC-02細(xì)胞的空白對(duì)照；4：腺病毒感染的PanC-02

圖1各組細(xì)胞CⅡTA蛋白表達(dá)

三、感染后表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的細(xì)胞百分比

感染24、48、72 h組表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的CaPanC-2細(xì)胞百分比分別為(8.1±0.3)%、(18.9±0.3)%、(78.5±0.9)%，顯著高于對(duì)照組的(7.0±0.1)%、(7.0±0.1)%、(6.9±0.2)%(P值均<0.01)；表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的PanC-02細(xì)胞百分比分別為(5.1±0.2)%、(37.3±2.0)%、(68.8±2.2)%，顯著高于對(duì)照組的(2.2±0.2)%、(2.2±0.2)%、(2.1±0.3)%(P值均<0.01)。

討 論

CⅡTA是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)的最關(guān)鍵因子之一,CⅡTA的表達(dá)降低可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)下降[4-6]，影響與MHCⅡ類(lèi)分子相關(guān)的免疫功能[7]。Satoh等[5]證實(shí)，高水平的MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)常與較好的腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)。因此，通過(guò)CⅡTA干預(yù)MHCⅡ類(lèi)分子功能可能是治療腫瘤的理想靶點(diǎn)。Lu等[8]應(yīng)用細(xì)胞感染方法將腫瘤細(xì)胞感染成MHC(+)/Ii(-)表型，然后種植到BALB/c鼠成瘤，結(jié)果有效引發(fā)了CD4+Th細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答。Meazza等[9]用CⅡTA基因轉(zhuǎn)染MHCⅡ缺乏的高度惡性的小鼠乳腺癌細(xì)胞株TS/A，恢復(fù)了MHCⅡ類(lèi)分子抗原表達(dá)，使其重新獲得了免疫原性。

本結(jié)果顯示，人胰腺癌細(xì)胞株CaPanC-2和小鼠胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anC-02均無(wú)CⅡTA的蛋白表達(dá)，感染后兩株細(xì)胞株中CⅡTA mRNA和蛋白的表達(dá)較前顯著增強(qiáng)，同時(shí)MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)亦顯著增強(qiáng)。由此證明，利用重組腺病毒載體制備新型、高效的腫瘤疫苗，外源性加入CⅡTA基因，可增強(qiáng)胰腺腫瘤細(xì)胞表面MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)胰腺腫瘤細(xì)胞抗原的識(shí)別，介導(dǎo)T細(xì)胞激活，對(duì)胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生免疫治療反應(yīng)。

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2011-03-25)

(本文編輯：呂芳萍)

RegulationofMHCclassⅡtransactivatoronMHCclassⅡexpressionofpancreaticcancercelllineCaPanC-2andPanC-02invitro

JIANGJing-xian，ZHANGMin-min，YANGHua，WUHong-yu，ZOUDuo-wu，LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:ZHANGMin-min,Email:minminzhang2002@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of MHC classⅡtransactivator(MHCⅡ TA ) on MHCⅡexpression of human and rat pancreatic cancer cell line CaPanC-2 and PanC-02.MethodsThe recombinant adenovirus (Ad-CⅡTA) was transfected into the CaPanC-2 cell and the PanC-02 cell, then it was cultured for 24, 48, 72 h. The CⅡTA mRNA expressions were assayed by Real Time PCR and CⅡTA protein expressions were determined by Western blotting. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ were measured by flow cytometry.ResultsThe CⅡTA mRNA expressions of CaPanC-2 cell at 24, 48, 72 h were 16769±6455, 261568±348850 and 834816±97783 folds higher than that of control group (P<0.05). The CⅡTA mRNA expressions of PanC-02 was 548546±87755, 1242684±624888 and 1401647±726145 folds higher than that of control group (P<0.05). CⅡTA protein was not expressed in CaPanC-2 cell and PanC-02 cell. After transfection for 48 h, the CⅡTA protein expressions of CaPanC-2 and PanC-02 were 0.746±0.499 and 0.631±0.244. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ in CaPanC-2 cells after 24, 48, 72 h were (8.1±0.3)%, (18.9±0.3)%, (78.5±0.90%, which were significantly higher than that in control group [(7.0±0.1)%,P<0.01. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ in PanC-02 were (5.1±0.2)%, (37.3±2.0)%, (68.8±2.2)%, which were significantly higher than that in control group [(2.2±0.2)%,P<0.01).ConclusionsTransfection of Ad-CⅡTA could increase the expression of CⅡTA and MHC Ⅱ molecules of pancreatic tumor cells in vitro.

Pancreatic neoplasms; Major histocompatibility complex; Adenoviruses; Infection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.007

國(guó)家自然科學(xué)基金(30600752)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

張敏敏，Email: minminzhang2002@126.com