毛姍姍， 趙正言

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院兒童保健科，浙江 杭州 310003)

甲狀腺功能減退對(duì)新生仔鼠心肌肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響*

毛姍姍， 趙正言△

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院兒童保健科，浙江 杭州 310003)

目的探討甲狀腺功能減退(甲減)對(duì)新生仔鼠心肌肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA2a)、磷酸受納蛋白(PLB) mRNA表達(dá)以及肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的影響，并觀察左旋甲狀腺素(L-T4)替代治療后以上指標(biāo)的改變。方法SD孕鼠自孕15 d起每天予丙基硫氧嘧啶(PTU)(50mg/d)灌胃至仔鼠出生并持續(xù)整個(gè)哺乳期，制成圍生期甲減模型，并對(duì)部分甲減仔鼠自出生當(dāng)天起每天腹腔注射L-T4(20 μg /kg)。收集甲減、治療及對(duì)照組出生3、5、7日齡的仔鼠心室肌組織(每組10只)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)SERCA2a及PLB mRNA含量，并同時(shí)采用熒光分光光度計(jì)法測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣(MyoCa2+)濃度，無(wú)機(jī)磷酸根法檢測(cè)心肌肌漿網(wǎng)鈣泵活性。結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示甲減組新生仔鼠心肌SERCA2a mRNA水平下降(Plt;0.05)，PLB mRNA水平升高(Plt;0.01)，SERCA2a/PLB下降(Plt;0.01);L-T4治療組仔鼠SERCA2a mRNA水平較甲減組上升(Plt;0.05)，PLB mRNA水平下降(Plt;0.05)，SERCA2a/PLB上升(Plt;0.01)。心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度檢測(cè)結(jié)果顯示甲減組心肌細(xì)胞MyoCa2+濃度較同日齡對(duì)照組升高(Plt;0.01);L-T4治療組仔鼠心肌細(xì)胞MyoCa2+濃度低于同日齡甲減組仔鼠(Plt;0.05)。酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示甲減組仔鼠肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性低于同日齡對(duì)照組(Plt;0.01);L-T4治療組仔鼠肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性較同日齡甲減組仔鼠升高(Plt;0.05)。結(jié)論甲狀腺激素缺乏可使新生大鼠肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性降低，并下調(diào)SERCA2a表達(dá)，上調(diào)PLB表達(dá)；肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SERCA2a與PLB參與調(diào)控圍生期甲減誘發(fā)的新生仔鼠心功能下降。

甲狀腺功能減退癥； 肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶； 磷酸受納蛋白； 大鼠，新生

先天性甲狀腺功能減退癥(congenital hypothyroidism，CH)是兒科較常見的一種內(nèi)分泌疾病，由于其圍生期甲狀腺激素減少，可對(duì)出生患兒的生長(zhǎng)和智力發(fā)育造成嚴(yán)重影響[1]，除了主要對(duì)大腦造成嚴(yán)重?fù)p傷之外，近年來(lái)CH對(duì)心臟器官的影響倍受關(guān)注，我們前期的研究已證實(shí)CH對(duì)新生兒就可造成心臟收縮和舒張功能損傷，經(jīng)過(guò)早期甲狀腺素替代治療可得到逆轉(zhuǎn)[2]，但其可能機(jī)制尚未明確。肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a，SERCA2a)是肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)膜上重要的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)心肌細(xì)胞收縮期和舒張期Ca2+濃度調(diào)節(jié)均發(fā)揮著十分重要的作用[3-5]。磷酸受納蛋白(phospholamban，PLB)是存在于肌漿網(wǎng)中的內(nèi)源性抑制物，通過(guò)蛋白激酶磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)SERCA2a對(duì)Ca2+的親和力[6-8]，SERCA2a與PLB之間的定量變化是調(diào)節(jié)心臟收縮和舒張功能改變的一個(gè)重要因素[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立圍生期甲減及甲狀腺素替代治療仔鼠模型，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)方法從mRNA水平定量分析鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SERCA2a及PLB含量的變化，同時(shí)采用熒光分光光度計(jì)法測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣(calcium in myocardium，MyoCa2+)濃度，無(wú)機(jī)磷酸根法檢測(cè)各組新生仔鼠的肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，以觀察仔鼠鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及表型的變化，探討圍生期甲減誘發(fā)新生仔鼠心功能下降的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)SD懷孕大鼠(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)(南通精華制藥有限公司)；左旋甲狀腺素(levothyroxine，L-T4)(Sigma)；游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)及促甲狀腺激素(thyrotropin，TSH)試劑盒(DPC)；考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒、ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Trizol、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(RTase)、Taq酶(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；引物合成(Invitrogen)。

2方法

2.1動(dòng)物模型的制備和分組 清潔級(jí)SD孕鼠自孕15 d起予PTU(50 mg/d)灌胃至仔鼠出生并持續(xù)整個(gè)哺乳期，出生仔鼠為甲減鼠。部分甲減仔鼠自出生當(dāng)日起每日予以腹腔注射L-T4(20 μg /kg)，為L(zhǎng)-T4治療組。其余孕鼠每天予生理鹽水灌胃，出生仔鼠為對(duì)照組。取3、5、7日齡仔鼠各10只，稱體重(body weight，BW)后斷頭處死，并立即開胸取出心臟置于冰生理鹽水中，剪去心房、腱索及脂肪組織，并洗凈血液，濾紙吸干水分，稱心室凈重量(heart weight，HW)后立即至液氮中凍存。

2.2血清甲狀腺激素水平測(cè)定 分離各組仔鼠血清，采用天津德普(diagnostic products corporation，DPC)生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的IMMULITE全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒測(cè)定血清FT3、FT4和TSH水平。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

① 總RNA提取與cDNA合成 取30 mg左右心肌組織采用Trizol一步法提取總RNA，采用Du-640紫外分光光度儀檢測(cè)RNA純度及濃度。取RNA模板5 μL，利用AMV RTase逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，總反應(yīng)體系為20 μL。RNA模板5 μL，Oligo-dT(0.165 g/L)3 μL，加RNase-free雙蒸水定容至11.5 μL，輕輕混勻后離心3-5 s；混合物70 ℃反應(yīng)5 min，冰浴30 s(0 ℃)，離心3-5 s；分別加入5×Buffer 4 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，混勻后離心3-5 s；37 ℃反應(yīng)5 min；加入AMV RTase2 μL，終體積為20 μL，37 ℃反應(yīng)60 min，94 ℃反應(yīng)5 min，結(jié)束反應(yīng)，置于-20 ℃保存。

② 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 檢索基因文庫(kù)大鼠SERCA2a及PLB序列，參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物序列，引物由上海Invitrogen合成。SERCA2a序列上游5’-ATGAGATCACAGCTATGACTGGTG-3’，下游5’-GCATTGCACATCTCTATGGTGACTAG-3’，產(chǎn)物651 bp；PLB序列上游5’-TACCTTACTCGCTCGGCTATC-3’，下游5’-CAGAAGCATCACAATGATGCAG-3’，產(chǎn)物141 bp；內(nèi)參照β-actin上游5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’，下游5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3’，產(chǎn)物312 bp。

總反應(yīng)體系為50 μL，其中cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Buffer 25 μL，目標(biāo)產(chǎn)物的引物2 μL(上、下游各1 μL)，β-actin引物2 μL(上下游各1 μL)，RNase-free雙蒸水補(bǔ)足至50 μL，混勻后在ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因擴(kuò)增儀(ABI)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件分別為：預(yù)變性 94 ℃4 min，94 ℃15 s，60 ℃1 min，共40次循環(huán)；隨后進(jìn)行溶解曲線反應(yīng)，得到所有標(biāo)本的所有記錄點(diǎn)曲線。ABI Prism 7500 SDS軟件將自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，調(diào)整基線，計(jì)算出threshold cycle (CT值)，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。根據(jù)每個(gè)樣本的CT值，通過(guò)公式計(jì)算出每個(gè)相對(duì)于內(nèi)參照β-actin的定量，從而比較各組樣本的表達(dá)變化情況。

2.4MyoCa2+濃度測(cè)定 取30 g左右心室肌組織參照Beuckelmann等[10]方法測(cè)定并加以改良。LC-240型熒光分光光度計(jì)(P-E)測(cè)定細(xì)胞懸液熒光F(激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm)。分別加入0.1%Triton X-100和2.5 mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)后測(cè)定最大熒光值(Fmax)和最小熒光值(Fmin)。按公式(F-Fmin)/×Fmax-F)×224計(jì)算MyoCa2+濃度，單位為nmol/L。

2.5肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性測(cè)定 參照J(rèn)ones等[11]差速離心法制備肌漿網(wǎng)，所有操作均在冰上完成。取液氮中凍存30 mg左右心室肌1塊，剪碎后置離心管，加入5倍體積A液(10 mmol/L NaHCO3，5 mmol/L NaN3，pH 7.0)，冰上勻漿后13 000×g離心10 min，留上清液，沉淀加5倍A液，勻漿后13 000×g離心10 min，留上清液加第1次上清液合并后13 000×g離心20 min，棄沉淀，上清液再離心(43 000×g)30 min，棄上清液，沉淀加2倍體積B液(0.6 mol/L KCl，30 mmol/L組氨酸，pH 7.0)，混勻再離心(43 000×g)30 min，棄上清液，沉淀加1 mL C液(0.25 mol/L蔗糖，30 mmol/L組氨酸，pH 7.0)充分混勻，取100 μL采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定肌漿網(wǎng)蛋白濃度，無(wú)機(jī)磷酸根法測(cè)定肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性。酶活性單位為1 mmol Pi·g-1protein·h-1。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

重復(fù)腎及輸尿管畸形及輸尿管異位開口,是泌尿系常見的先天畸形疾病。根據(jù)畸形部位和特征,重復(fù)腎及輸尿管畸形分為完全性、不完全性兩種。完全性重復(fù)指一側(cè)或雙側(cè)輸尿管全長(zhǎng)重復(fù),輸尿管可分別開口于膀胱或尿道等部位;不完全性重復(fù)指一側(cè)或雙側(cè)輸尿管部分重復(fù)、匯合后共同開口于膀胱。單側(cè)重復(fù)較雙側(cè)多6倍。完全重復(fù)時(shí),上輸尿管口位于下內(nèi)側(cè),而下輸尿管口位于上外側(cè)。如果重復(fù)的輸尿管開口于膀胱以外,則稱為輸尿管異位開口。該疾病女性多于男性,臨床表現(xiàn)取決于異位開口部位,男性異位開口多見于后尿道及精囊,女性多見于尿道、前庭和陰道,女性患者的典型癥狀是既有正常自行排尿,又有持續(xù)漏尿或尿失禁。

結(jié) 果

1動(dòng)物模型表型與行為特征改變(表1)

各組新生仔鼠BW比較差異顯著(Plt;0.01)。正常對(duì)照組新生仔鼠體重增加快，活動(dòng)性強(qiáng)。甲減組新生仔鼠體重增加緩慢，顯著低于同日齡正常組新生仔鼠(Plt;0.01)，且體形小，尾短，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，張眼晚。L-T4治療組新生仔鼠一般情況較甲減組仔鼠有明顯改善，體形增大、反應(yīng)靈敏度增強(qiáng)，體重較同日齡甲減組仔鼠顯著增加(Plt;0.01)，但仍低于同日齡正常組仔鼠水平(Plt;0.01)。

表1 各組新生仔鼠BW、HW和HW/BW重的比較

2HW和HW/BW的變化(表1)

甲減組新生仔鼠HW顯著低于同日齡對(duì)照組仔鼠(Plt;0.05)，但HW/BW無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；L-T4治療組各日齡段新生仔鼠HW顯著高于甲減組同日齡仔鼠(Plt;0.01)，除3日齡外(Pgt;0.05)，L-T4治療組HW/BW較同日齡甲減組仔鼠顯著升高(5、7日齡Plt;0.05)。

3血清甲狀腺激素水平的變化(表2)

甲減組新生仔鼠各日齡段血清FT4水平接近藥盒檢測(cè)底限(2.8 pmol/L)，明顯低于同日齡對(duì)照組新生仔鼠(Plt;0.01)；血清FT3水平較同日齡對(duì)照組仔鼠相比也顯著降低(Plt;0.01)；血清TSH水平較同日齡對(duì)照組仔鼠顯著升高(Plt;0.01)。L-T4治療組仔鼠血清FT3和FT4水平較同日齡甲減組仔鼠顯著升高(Plt;0.01)，血清TSH水平顯著下降(Plt;0.01)，但治療組各激素水平均尚未達(dá)到同日齡正常組水平(Plt;0.05)。

表2 各組新生仔鼠血清FT3、FT4與TSH水平的比較

4心肌SERCA2a與PLBmRNA表達(dá)變化(表3)

表3 各組新生仔鼠心肌SERCA2a、PLB及SERCA2a/PLB mRNA水平的比較

5MyoCa2+濃度的變化(圖1)

各組間同日齡MyoCa2+濃度具有顯著差異(Plt;0.01)，3、5、7日齡甲減組仔鼠MyoCa2+濃度分別為(131.63±33.86)nmol/L、(152.74±38.67)nmol/L、(188.23±42.33)nmol/L，顯著高于同日齡對(duì)照組(88. 34±27.43)nmol/L、(95.23±28.92)nmol/L、(110.22±31.52)nmol/L(Plt;0.01)。3、5、7日齡L-T4治療組仔鼠MyoCa2+濃度分別為(100.30±29.69)nmol/L、(116.65±31.75)nmol/L、(137.52±34.43)nmol/L，顯著低于同日齡甲減組仔鼠(Plt;0.05)。

6心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化(圖2)

對(duì)照組、甲減組與L-T4治療組新生仔鼠的肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性隨著日齡增加而增加。各組間同日齡心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性具有顯著差異(Plt;0.01)，3、5、7日齡甲減組仔鼠肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性分別為(1.57±0.26)mmol Pi·g-1protein·h-1、(1.78±0.33)mmol Pi·g-1protein·h-1、(2.06±0.32)mmol Pi·g-1protein·h-1，顯著低于同日齡對(duì)照組(2.34±0.42)mmol Pi·g-1protein·h-1、(2.68±0.44)mmol Pi·g-1protein·h-1、(3.21±0.50)mmol Pi·g-1protein·h-1(Plt;0.01)，分別降低32.91%、33.58%、35.83 %。3、5、7日齡L-T4治療組仔鼠肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性分別為(1.98±0.35)mmol Pi·g-1protein·h-1、(2.29±0.40)mmol Pi·g-1protein·h-1、(2.70±0.42)mmol Pi·g-1protein·h-1，顯著高于同日齡甲減組仔鼠(Plt;0.05)，分別上升26.11%、28.65%、31.07%，但仍低于同日齡對(duì)照組(Plt;0.05)。

Figure 1. Analysis of concentration of ventricular MyoCa2+ in hypothyroid, L-T4 and control groups. ±s. n=10. *plt;0.05 vs control group; #Plt;0.05 vs hypothroid group.

Figure 2. Analysis of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase activity in hypothyroid, L-T4 and control groups. ±s. n=10. *Plt;0.05 vs control group;#Plt;0.05 vs hypothroid group.

討 論

甲狀腺激素是調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能的一種重要生理性激素，可影響到細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)合成和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其對(duì)小兒生長(zhǎng)發(fā)育和多器官系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用。圍生期甲狀腺功能減退是由胎兒甲狀腺發(fā)育不良或者孕母甲狀腺激素缺乏引起，出生患兒即表現(xiàn)為先天性甲狀腺功能減退。本實(shí)驗(yàn)在孕鼠孕15 d至生后15日齡給予PTU灌胃，所生仔鼠體重減輕，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，血清FT3、FT4下降，TSH升高，提示模型制備是成功的。本研究同時(shí)給予部分甲減仔鼠以L-T4治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-T4替代治療后仔鼠血清甲狀腺激素水平顯著上升，替代治療對(duì)恢復(fù)甲狀腺功能有顯著效果，然而甲減仔鼠在短期內(nèi)(7日齡)尚未到達(dá)正常水平，推測(cè)可能與替代治療持續(xù)時(shí)間或治療劑量有關(guān)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)新生甲減仔鼠BW與HW均顯著下降，HW/BW無(wú)顯著變化，提示體內(nèi)低甲狀腺激素水平對(duì)體格生長(zhǎng)及心臟的發(fā)育成熟均產(chǎn)生了顯著的影響。經(jīng)L-T4治療后，新生仔鼠BW與HW均明顯上升，其中HW在7日齡時(shí)已接近正常水平，HW/BW在5日齡和7日齡時(shí)也均高于甲減組仔鼠，7日齡還高于正常組仔鼠，提示隨著甲狀腺功能的逐漸恢復(fù)，仔鼠體格生長(zhǎng)與心臟發(fā)育均呈現(xiàn)追趕現(xiàn)象，且隨著日齡增長(zhǎng)和激素水平的提高，對(duì)心臟的發(fā)育的影響似乎更大。

心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化是細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)和心肌收縮舒張功能的主要決定因子。胞漿內(nèi)游離鈣濃度異常增高可致心肌細(xì)胞鈣超載，從而導(dǎo)致心功能障礙。心肌肌漿網(wǎng)則是調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶為存在于肌漿網(wǎng)上調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的最重要的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要靠水解ATP將細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+逆濃度梯度泵入肌漿網(wǎng)內(nèi)，使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度急劇下降而介導(dǎo)舒張，同時(shí)肌漿網(wǎng)內(nèi)貯存的Ca2+又將是下一次心肌收縮的基礎(chǔ)[4,5]。磷酸受納蛋白(PLB)是存在于肌漿網(wǎng)中的內(nèi)源性抑制物，為肌漿網(wǎng)鈣泵的活性調(diào)節(jié)蛋白。PLB的過(guò)度表達(dá)可抑制SERCA2a的活性，降低其對(duì)Ca2+的親和力, Ca2+濃度減少，從而引起心肌細(xì)胞收縮和舒張頻率下降，心肌收縮時(shí)間延長(zhǎng)。

鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在調(diào)控成年甲減動(dòng)物心功能改變中的可能機(jī)制已有部分研究，其中有報(bào)道大鼠和兔的SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)均下降，給予T3治療后SERCA2a表達(dá)可顯著上升[12]，然而對(duì)于PLB表達(dá)的研究結(jié)果并不一致，甲減動(dòng)物心肌PLB的表達(dá)變化為上升或下降甚至無(wú)變化者均有報(bào)道[12-14]。迄今為止關(guān)于甲狀腺激素對(duì)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)大多局限于成年動(dòng)物模型的研究，而圍生期甲減是否會(huì)對(duì)出生的新生仔鼠心肌肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響以及甲狀腺素替代治療的反應(yīng)如何，目前則尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)real-time PCR方法對(duì)各組新生仔鼠的心肌SERCA2a及PLB mRNA表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)甲減仔鼠SERCA2a mRNA表達(dá)下降，PLB mRNA表達(dá)升高，說(shuō)明甲狀腺激素減少直接影響了SERCA2a及PLB的基因轉(zhuǎn)錄水平，由于SERCA2a表達(dá)的下調(diào)及PLB表達(dá)的上調(diào)，SERCA2a/PLB比值下降，對(duì)Ca2+-ATP酶活性的抑制作用加強(qiáng)，使后者對(duì)胞漿內(nèi)游離Ca2+的再攝取功能減低，出現(xiàn)松弛功能障礙。經(jīng)L-T4替代治療后，SERCA2a mRNA表達(dá)顯著上升，PLB mRNA表達(dá)顯著下降，兩者比例上升，提示甲狀腺素替代治療對(duì)調(diào)整鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，從而最終改善心功能十分有效。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)治療組仔鼠其SERCA2a mRNA表達(dá)在短期治療(5-7 d)后可達(dá)到正常對(duì)照組水平，提示甲狀腺激素水平的上升對(duì)SERCA2a mRNA表達(dá)的影響較大，替代治療可在短期內(nèi)使之完全恢復(fù)正常。然而PLB mRNA表達(dá)以及兩者比例SERCA2a/PLB仍未達(dá)到正常組水平，推測(cè)其原因可能與甲狀腺激素水平尚未在短期內(nèi)恢復(fù)正常有關(guān)，繼續(xù)替代治療是否能完全逆轉(zhuǎn)尚需進(jìn)一步研究。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)新生甲減大鼠MyoCa2+濃度升高，肌漿網(wǎng)鈣泵活性顯著下降，說(shuō)明甲狀腺激素水平可影響肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，引起肌漿網(wǎng) Ca2+攝取速度減慢和攝取量減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載，心肌舒張緩慢和舒張不完全，繼而再影響心肌興奮-收縮偶聯(lián)，最終引起心肌收縮力降低。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)部分新生甲減仔鼠進(jìn)行L-T4替代治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后隨著甲狀腺激素水平的上升，其MyoCa2+濃度顯著降低，提示甲狀腺素替代治療能減輕甲減引起的心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣增高，并使肌漿網(wǎng)鈣泵活性增加，但在7日齡內(nèi)尚未到達(dá)正常組水平，鈣泵活性在生后早期短期替代治療后未能完全恢復(fù)正常，推測(cè)可能與甲狀腺功能尚未完全恢復(fù)正常有關(guān)。

綜上所述，本研究提示甲狀腺激素減少可使新生大鼠心肌SERCA2a表達(dá)下降，PLB表達(dá)上升，SERCA2a/PLB比值下降，直接抑制了肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，這一系列反應(yīng)可能為先天性甲狀腺功能減退癥引起新生兒心臟收縮和舒張功能下降[2]的重要分子機(jī)制之一，早期L-T4替代治療后以上指標(biāo)可得到部分或全部恢復(fù)，從而促使受損心功能在生后短期內(nèi)得到改善。

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AlterationofmyocardialsarcoplasmicreticulumCa2+transportproteinexpressioninneonatalhypothyroidrats

MAO Shan-shan, ZHAO Zheng-yan

(1DepartmentofChildHealthCare,TheChildren’sHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,China.E-mail:maoshanshan33@163.com)

AIM: To investigate the alteration of sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+transport proteins including sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a(SERCA2a) and phospholamban(PLB) mRNA expression as well as the alteration of myocardial SR Ca2+-ATPase activity in neonatal hypothyroid rats, and to explore the effect of levothyroxine(L-T4) substitution therapy on the above indexes.METHODSHypothyroidism was induced by the administration of propylthiouracil (PTU, 50 mg/d) to the pregnant SD rats by gavage beginning on embryonic day 15 and continuing throughout the lactational period. A subgroup of neonatal hypothyroid rats were intraperitoneally injected with L-T4levothroxine (20 μg/kg BW daily), starting from the day of birth. Other pregnant SD rats

normal saline instead of PTU. The samples of the rats in all 3 groups were harvested at postnatal day 3, 5 and 7 respectively (n=10). After measurement of serum thyroid hormone levels, the hearts were removed and the ventricles were weighed (HW). The concentration of calcium in ventricular myocardium(ventricular myoCa2+) was detected by fluorospectrophotometry and the activity of SR Ca2+-ATPase was determined by the inorganic phosphorus method. The mRNA expression of SERCA2a and PLB was also detected by real-time PCR.RESULTSNeonatal hypothyroid rats had a significant lower level of SERCA2a mRNA (Plt;0.05) and a higher level of PLB mRNA (Plt;0.01), and subsequent lower SERCA2a/PLB at each postnatal day (Plt;0.01) was observed. Compared with hypothyroid group, the mRNA expression of SERCA2a significantly increased (Plt;0.05) and that of PLB significantly decreased (Plt;0.05) in L-T4treatment group. The concentration of ventricular MyoCa2+in hypothyroid group was significantly higher than that in control group (Plt;0.01), and that in L-T4treatment group showed a significant decrease as compared with hypothyroid group (Plt;0.05). The activity of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in hypothyroid group was significantly lower than that in control group (Plt;0.01), and that in L-T4treatment group showed a significant increase as compared to hypothyroid group (Plt;0.05).CONCLUSIONThe deficiency of thyroid hormone, resulting in decreased expression of SERCA2a mRNA as well as increased PLB mRNA, contributes to the reduction of SR Ca2+-ATPase activity in neonatal rats. This may be one of the most important mechanisms of myocardial systolic and diastolic dysfunctions.

Hypothyroidism; Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase; Phospholamban; Rats,neonatal

1000-4718(2011)04-0763-06

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.027

2010-09-25

2011-02-25

浙江省教育廳科研資助項(xiàng)目(No.Y201019211)

△通訊作者 Tel：0571-87061007-12121; E-mail:maoshanshan33 @163.com