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        亞低溫治療對大鼠腦梗死后Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

        2011-11-20 05:21:18王玉凱陶恩祥
        卒中與神經(jīng)疾病 2011年5期
        關(guān)鍵詞:常溫百分比陽性細(xì)胞

        王玉凱 任 麗 陶恩祥

        亞低溫可以降低腦缺血后細(xì)胞代謝率、減少細(xì)胞能量消耗、降低血管的通透性等減輕腦損傷后的腦水腫、降低顱內(nèi)壓,有效降低腦代謝活動,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[1~4],但亞低溫治療對缺血性腦損傷的保護(hù)作用的具體機(jī)制還不確定。本研究的目的通過急性腦梗死的大鼠模型,觀察亞低溫條件下Bax、Bcl-2的表達(dá)變化,探討亞低溫治療缺血性腦損傷的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 動物模型建立及分組

        SPF級雄性健康SD 大鼠46只,由中山大學(xué)北校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心提供(體重280~330 g)。符合國家衛(wèi)生部頒發(fā)的實(shí)驗(yàn)動物清潔級標(biāo)準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證許可證號:SCXK(粵)2004-0011 粵監(jiān)證號2008A010)。模型制備在中山大學(xué)北校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心完成(屏蔽動物實(shí)驗(yàn)室使用證明編號:NO:0021275),手術(shù)場所及所用器具嚴(yán)格消毒,全部操作在無菌條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心,動物房光暗周期12 h。

        根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將模型鼠隨機(jī)分為常溫組(normal temperature group,NT)10 只、亞低溫組(mild hypothermic group,HT)30只,亞低溫組又分3 h組、6 h組、12 h組,每組各10只。各實(shí)驗(yàn)分組每一時間點(diǎn)每種檢測方法(TTC 染色和免疫組化)各選取5只大鼠用于觀察。

        所有大鼠術(shù)前12 h 禁食,術(shù)前6 h 禁水,線栓法制作局灶性腦梗死模型[5]。常溫組大鼠手術(shù)過程中用電暖器維持肛溫在37~38℃,術(shù)后轉(zhuǎn)移到溫度為25 ℃的房間;亞低溫組大鼠分別在缺血后3、6、12 h采用噴灑酒精和電扇降溫的方法在10 min內(nèi)使肛溫降至30 ℃(相應(yīng)于腦溫33 ℃[6]),然后轉(zhuǎn)移到溫度為5 ℃的房間,在5 ℃的房間里維持大鼠肛溫在30 ℃[7],缺血24 h后取材觀察。

        假手術(shù)組(sham operation,SO)6 只大鼠:除不插魚線外,其余操作與模型組相同。術(shù)后把大鼠轉(zhuǎn)移到溫度為25℃的房間,每一時間點(diǎn)每種檢測方法(TTC染色和免疫組化)各選取3只大鼠用于觀察。

        1.2 動物模型神經(jīng)功能評分

        根據(jù)Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)[8]對各組動物模型在各時間點(diǎn)進(jìn)行評分。

        1.3 TTC 染色

        3.5%的水合氯醛過量麻醉大鼠,快速取腦組織放入-20℃冰箱,待組織凍硬后進(jìn)行冠狀位切片(片厚2 mm);放入2%TTC(避光)染色30 min(37℃),4%多聚甲醛固定24 h后拍照。用圖像分析軟件測定每張腦片的面積和梗死面積,由梗死面積×切片厚度=梗死灶體積,全腦面積×切片厚度=全腦體積[9],以梗死體積百分比=(梗死灶體積/全腦體積)表示缺血后腦損傷的嚴(yán)重程度。

        1.4 免疫組織化學(xué)

        經(jīng)灌注固定、梯度蔗糖脫水后,常規(guī)石蠟包埋,然后行冠狀位切片,片厚5μm,進(jìn)行免疫組化檢測;一抗為兔抗Bcl-2、Bax、caspase-3(SANGA CRUZ產(chǎn)品),二抗為生物素化山羊抗兔IgG(Boster公司產(chǎn)品),每張切片于高倍鏡(400倍×)下梗死灶周邊區(qū)皮質(zhì)和紋狀體的5個視野計(jì)數(shù),取其平均數(shù)[10]。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        2 結(jié) 果

        2.1 神經(jīng)功能評分

        假手術(shù)組大鼠不出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失的表現(xiàn),評分為0;常溫組和亞低溫組大鼠術(shù)后出現(xiàn)不同程度局灶性神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);亞低溫組大鼠神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)比常溫組輕,隨亞低溫治療開始時間的延后,神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)逐漸加重(P<0.05)(表1)。

        表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分(±s)

        表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分(±s)

        注:與NT 組比較,*P<0.05;與6 h、12 h組比較,△P<0.05;與12 h組比較,▲P<0.05。

        指標(biāo) SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組神經(jīng)功能評分 0 2.35±0.16 1.46±0.19*△1.93±0.16*▲2.12±0.17*

        2.2 腦梗死體積百分比

        假手術(shù)組無腦梗死灶出現(xiàn)。亞低溫組腦梗死體積百分比明顯小于常溫組(P<0.01);亞低溫各組腦梗死體積百分比:3 h<6 h<12 h(P<0.05)(表2)。

        表2 各組腦梗死體積百分比(±s,%)

        表2 各組腦梗死體積百分比(±s,%)

        注:與NT 組比較,*P<0.05;與6 h、12 h組比較,△P<0.05;與12 h組比較,▲P<0.05。

        指標(biāo) SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組腦梗死體積百分比 0 22.35±0.16 15.46±0.19*△17.93±0.16*▲20.13±0.17*

        2.3 免疫組織化學(xué)

        2.3.1 Bax表達(dá)變化 Bax表達(dá)陽性細(xì)胞僅胞漿著色呈棕黃色。常溫組和亞低溫組Bax表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增加。亞低溫組比常溫組Bax表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。亞低溫各組Bax表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù):3 h<6 h<12 h(P<0.05)(表3、圖1~4)。

        2.3.2 Bcl-2表達(dá)變化 Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。常溫組和亞低溫組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增加。亞低溫組比常溫組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。亞低溫各組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)依次是3 h>6 h>12 h(P<0.05)(表4、圖5~8)。

        表3 各組Bax陽性細(xì)胞數(shù)的比較(±s,個/每個400倍視野)

        表3 各組Bax陽性細(xì)胞數(shù)的比較(±s,個/每個400倍視野)

        注:與NT 組比較,*P<0.05;與6 h、12 h組比較,△P<0.05;與12 h組比較,▲P<0.05。

        指標(biāo) SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組Bax陽性細(xì)胞數(shù) 1.60±1.24 53.20±5.81 24.60±5.94*△ 38.00±4.00*▲ 46.00±7.58*

        表4 各組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s,個/每個400倍視野)

        表4 各組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s,個/每個400倍視野)

        注:與NT 組比較,*P<0.05;與6 h、12 h組比較,△P<0.05;與12 h組比較,▲P<0.05。

        指標(biāo) SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù) 2.40±1.14 21.60±5.94 43.20±5.81*△ 35.10±4.31*▲ 29.40±7.58*

        3 討 論

        腦缺血后神經(jīng)元的死亡有壞死和凋亡兩種,細(xì)胞凋亡參與缺血后梗死的發(fā)展。腦缺血后缺血中心區(qū)的神經(jīng)元以壞死為主,缺血邊緣區(qū)即半暗帶區(qū)神經(jīng)元則以凋亡為主。因此腦梗死后治療的一系列措施主要是針對缺血半暗帶進(jìn)行的。亞低溫能夠縮小梗死面積、減輕腦水腫和改善缺血癥狀等,這些作用均可起到抑制神經(jīng)元凋亡、阻止腦缺血后梗死灶進(jìn)展的作用。

        Bax是一種促凋亡蛋白,它表達(dá)增加可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是抗凋亡蛋白。二者存在于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,可以形成不同的二聚體,通過它們之間的不同比例來調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性,最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡或存活。本研究結(jié)果顯示,腦缺血后Bcl-2和Bax表達(dá)均上調(diào)。Bcl-2/Bax比值下降,凋亡細(xì)胞數(shù)增加[11],促進(jìn)Bcl-2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)可使Bcl-2/Bax比值增加,凋亡細(xì)胞數(shù)減少,起到腦保護(hù)作用[12~14]。

        文獻(xiàn)報道,亞低溫可使缺血腦組織的Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào),發(fā)揮腦保護(hù)作用[13~15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bax表達(dá)陽性細(xì)胞多位于缺血半暗帶區(qū),亦即缺血壞死區(qū)和正常腦組織的交界區(qū)域,證實(shí)Bax參與缺血后細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,亞低溫各組Bax表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均明顯少于常溫組,說明亞低溫治療可使Bax的表達(dá)下調(diào),提示亞低溫治療可能抑制或延緩了細(xì)胞凋亡。

        亞低溫各組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均明顯多于常溫組,說明亞低溫治療使Bcl-2 表達(dá)上調(diào)而抑制凋亡。Bcl-2和Bax蛋白含量的比值決定細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生,凋亡的神經(jīng)元會同時出現(xiàn)Bax表達(dá)升高和Bcl-2表達(dá)降低[16,17],隨著缺血時間的延長如果沒有新的刺激因素作用,Bcl-2表達(dá)降低,Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)減少。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亞低溫治療12h、6h、3h組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)呈遞增趨勢,說明早期亞低溫治療可抑制缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞的凋亡,延緩腦梗死進(jìn)一步發(fā)展。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,亞低溫組缺血3h、6h和12h的梗死體積百分比依次增加,而亞低溫各組在相應(yīng)時間點(diǎn)與常溫組比較梗死體積百分比均明顯縮小。說明腦缺血后早期亞低溫治療可縮小梗死體積的擴(kuò)大。由此可以推測亞低溫治療可能延緩了腦梗死的進(jìn)展,減輕缺血性腦損傷,也就是延長了臨床治療的時間窗。

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