王玉凱 任 麗 陶恩祥

亞低溫可以降低腦缺血后細(xì)胞代謝率、減少細(xì)胞能量消耗、降低血管的通透性等減輕腦損傷后的腦水腫、降低顱內(nèi)壓，有效降低腦代謝活動，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［1～4］，但亞低溫治療對缺血性腦損傷的保護(hù)作用的具體機(jī)制還不確定。本研究的目的通過急性腦梗死的大鼠模型，觀察亞低溫條件下Bax、Bcl－2的表達(dá)變化，探討亞低溫治療缺血性腦損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組

SPF級雄性健康SD 大鼠46只，由中山大學(xué)北校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（體重280～330 g）。符合國家衛(wèi)生部頒發(fā)的實(shí)驗(yàn)動物清潔級標(biāo)準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證許可證號：SCXK（粵）2004－0011 粵監(jiān)證號2008A010）。模型制備在中山大學(xué)北校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心完成（屏蔽動物實(shí)驗(yàn)室使用證明編號：NO：0021275），手術(shù)場所及所用器具嚴(yán)格消毒，全部操作在無菌條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物房光暗周期12 h。

根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將模型鼠隨機(jī)分為常溫組（normal temperature group，NT）10 只、亞低溫組（mild hypothermic group，HT）30只，亞低溫組又分3 h組、6 h組、12 h組，每組各10只。各實(shí)驗(yàn)分組每一時間點(diǎn)每種檢測方法（TTC 染色和免疫組化）各選取5只大鼠用于觀察。

所有大鼠術(shù)前12 h 禁食，術(shù)前6 h 禁水，線栓法制作局灶性腦梗死模型［5］。常溫組大鼠手術(shù)過程中用電暖器維持肛溫在37～38℃，術(shù)后轉(zhuǎn)移到溫度為25 ℃的房間；亞低溫組大鼠分別在缺血后3、6、12 h采用噴灑酒精和電扇降溫的方法在10 min內(nèi)使肛溫降至30 ℃（相應(yīng)于腦溫33 ℃［6］），然后轉(zhuǎn)移到溫度為5 ℃的房間，在5 ℃的房間里維持大鼠肛溫在30 ℃［7］，缺血24 h后取材觀察。

假手術(shù)組（sham operation，SO）6 只大鼠：除不插魚線外，其余操作與模型組相同。術(shù)后把大鼠轉(zhuǎn)移到溫度為25℃的房間，每一時間點(diǎn)每種檢測方法（TTC染色和免疫組化）各選取3只大鼠用于觀察。

1.2 動物模型神經(jīng)功能評分

根據(jù)Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)［8］對各組動物模型在各時間點(diǎn)進(jìn)行評分。

1.3 TTC 染色

3.5%的水合氯醛過量麻醉大鼠，快速取腦組織放入－20℃冰箱，待組織凍硬后進(jìn)行冠狀位切片（片厚2 mm）；放入2%TTC（避光）染色30 min（37℃），4%多聚甲醛固定24 h后拍照。用圖像分析軟件測定每張腦片的面積和梗死面積，由梗死面積×切片厚度＝梗死灶體積，全腦面積×切片厚度＝全腦體積［9］，以梗死體積百分比＝（梗死灶體積／全腦體積）表示缺血后腦損傷的嚴(yán)重程度。

1.4 免疫組織化學(xué)

經(jīng)灌注固定、梯度蔗糖脫水后，常規(guī)石蠟包埋，然后行冠狀位切片，片厚5μm，進(jìn)行免疫組化檢測；一抗為兔抗Bcl－2、Bax、caspase－3（SANGA CRUZ產(chǎn)品），二抗為生物素化山羊抗兔IgG（Boster公司產(chǎn)品），每張切片于高倍鏡（400倍×）下梗死灶周邊區(qū)皮質(zhì)和紋狀體的5個視野計(jì)數(shù)，取其平均數(shù)［10］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評分

假手術(shù)組大鼠不出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失的表現(xiàn)，評分為0；常溫組和亞低溫組大鼠術(shù)后出現(xiàn)不同程度局灶性神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；亞低溫組大鼠神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)比常溫組輕，隨亞低溫治療開始時間的延后，神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)逐漸加重（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分（±s）

注：與NT 組比較，＊P＜0.05；與6 h、12 h組比較，△P＜0.05；與12 h組比較，▲P＜0.05。

指標(biāo) SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組神經(jīng)功能評分 0 2.35±0.16 1.46±0.19＊△1.93±0.16＊▲2.12±0.17＊

2.2 腦梗死體積百分比

假手術(shù)組無腦梗死灶出現(xiàn)。亞低溫組腦梗死體積百分比明顯小于常溫組（P＜0.01）；亞低溫各組腦梗死體積百分比：3 h＜6 h＜12 h（P＜0.05）（表2）。

表2 各組腦梗死體積百分比（±s，%）

表2 各組腦梗死體積百分比（±s，%）

注：與NT 組比較，＊P＜0.05；與6 h、12 h組比較，△P＜0.05；與12 h組比較，▲P＜0.05。

指標(biāo) SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組腦梗死體積百分比 0 22.35±0.16 15.46±0.19＊△17.93±0.16＊▲20.13±0.17＊

2.3 免疫組織化學(xué)

2.3.1 Bax表達(dá)變化 Bax表達(dá)陽性細(xì)胞僅胞漿著色呈棕黃色。常溫組和亞低溫組Bax表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增加。亞低溫組比常溫組Bax表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。亞低溫各組Bax表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)：3 h＜6 h＜12 h（P＜0.05）（表3、圖1～4）。

2.3.2 Bcl－2表達(dá)變化 Bcl－2表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。常溫組和亞低溫組Bcl－2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增加。亞低溫組比常溫組Bcl－2陽性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）。亞低溫各組Bcl－2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)依次是3 h＞6 h＞12 h（P＜0.05）（表4、圖5～8）。

表3 各組Bax陽性細(xì)胞數(shù)的比較（±s，個／每個400倍視野）

表3 各組Bax陽性細(xì)胞數(shù)的比較（±s，個／每個400倍視野）

注：與NT 組比較，＊P＜0.05；與6 h、12 h組比較，△P＜0.05；與12 h組比較，▲P＜0.05。

指標(biāo) SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組Bax陽性細(xì)胞數(shù) 1.60±1.24 53.20±5.81 24.60±5.94＊△ 38.00±4.00＊▲ 46.00±7.58＊

表4 各組Bcl－2陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s，個／每個400倍視野）

表4 各組Bcl－2陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s，個／每個400倍視野）

注：與NT 組比較，＊P＜0.05；與6 h、12 h組比較，△P＜0.05；與12 h組比較，▲P＜0.05。

指標(biāo) SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組Bcl－2陽性細(xì)胞數(shù) 2.40±1.14 21.60±5.94 43.20±5.81＊△ 35.10±4.31＊▲ 29.40±7.58＊

3 討 論

腦缺血后神經(jīng)元的死亡有壞死和凋亡兩種，細(xì)胞凋亡參與缺血后梗死的發(fā)展。腦缺血后缺血中心區(qū)的神經(jīng)元以壞死為主，缺血邊緣區(qū)即半暗帶區(qū)神經(jīng)元則以凋亡為主。因此腦梗死后治療的一系列措施主要是針對缺血半暗帶進(jìn)行的。亞低溫能夠縮小梗死面積、減輕腦水腫和改善缺血癥狀等，這些作用均可起到抑制神經(jīng)元凋亡、阻止腦缺血后梗死灶進(jìn)展的作用。

Bax是一種促凋亡蛋白，它表達(dá)增加可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl－2是抗凋亡蛋白。二者存在于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，可以形成不同的二聚體，通過它們之間的不同比例來調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡或存活。本研究結(jié)果顯示，腦缺血后Bcl－2和Bax表達(dá)均上調(diào)。Bcl－2／Bax比值下降，凋亡細(xì)胞數(shù)增加［11］，促進(jìn)Bcl－2表達(dá)、抑制Bax表達(dá)可使Bcl－2／Bax比值增加，凋亡細(xì)胞數(shù)減少，起到腦保護(hù)作用［12～14］。

文獻(xiàn)報道，亞低溫可使缺血腦組織的Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl－2表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮腦保護(hù)作用［13～15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bax表達(dá)陽性細(xì)胞多位于缺血半暗帶區(qū)，亦即缺血壞死區(qū)和正常腦組織的交界區(qū)域，證實(shí)Bax參與缺血后細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞低溫各組Bax表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均明顯少于常溫組，說明亞低溫治療可使Bax的表達(dá)下調(diào)，提示亞低溫治療可能抑制或延緩了細(xì)胞凋亡。

亞低溫各組Bcl－2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均明顯多于常溫組，說明亞低溫治療使Bcl－2 表達(dá)上調(diào)而抑制凋亡。Bcl－2和Bax蛋白含量的比值決定細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生，凋亡的神經(jīng)元會同時出現(xiàn)Bax表達(dá)升高和Bcl－2表達(dá)降低［16，17］，隨著缺血時間的延長如果沒有新的刺激因素作用，Bcl－2表達(dá)降低，Bcl－2陽性細(xì)胞數(shù)減少。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亞低溫治療12h、6h、3h組Bcl－2表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)呈遞增趨勢，說明早期亞低溫治療可抑制缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞的凋亡，延緩腦梗死進(jìn)一步發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞低溫組缺血3h、6h和12h的梗死體積百分比依次增加，而亞低溫各組在相應(yīng)時間點(diǎn)與常溫組比較梗死體積百分比均明顯縮小。說明腦缺血后早期亞低溫治療可縮小梗死體積的擴(kuò)大。由此可以推測亞低溫治療可能延緩了腦梗死的進(jìn)展，減輕缺血性腦損傷，也就是延長了臨床治療的時間窗。

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