江海 曹小勇 吳三橋等

摘要：建立了測定石蒜中加蘭他敏含量的高效液相色譜法。以梯度乙腈－０．２%磷酸為流動相，Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）為固定相，流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ，柱溫為２０ ℃，檢測波長為２８９ ｎｍ，對加蘭他敏進行分析。結(jié)果表明，加蘭他敏在該色譜條件下與其他組分均能有效分離，符合分析條件。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；加蘭他敏；石蒜；含量

中圖分類號：Ｏ６５７．７＋２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）16－3389-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ ｉｎ Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ ｂｙ ＨＰＬＣ

ＪＩＡＮＧ Ｈａｉ１，２，ＣＡＯ Ｘｉａｏ－ｙｏｎｇ２，ＷＵ Ｓａｎ－ｑｉａｏ１，ＬＩ Ｘｉｎ－ｓｈｅｎｇ１，ＬＩ Ｚｉ－ｘｕａｎ２，ＷＡＮＧ Ｙｕ－ｔｉｎｇ２

（１． Ｓｈａａｎｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅ， Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｇａｌａｎｔhａｍｉｎｅ ｉｎ Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（１５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅ ｗｉｔｈ ａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ａｎｄ ０．２％ Ｈ３ＰＯ４ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １ ｍＬ／ｍｉｎ ａｔ ２０ ℃， ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ２８９ ｎｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｇｏｏｄ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＨＰＬＣ； ｇａｌａｎｔhａｍｉｎｅ； Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ； ｃｏｎｔｅｎｔ

石蒜（Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ）別名老鴉蒜，龍爪花，屬于石蒜科石蒜屬，多年生草本，葉帶狀，深綠色帶白霜粉，分布于長江流域以南各省區(qū)，喜生于林緣、河岸陰濕處［１］。該屬植物花朵色澤鮮艷，其品種眾多，有紅花、粉紅花、黃花、淡紅紫色、百合型、白長筒型等，形態(tài)別致，是一種具鱗莖的花卉植物，具有良好的觀賞價值。石蒜鱗莖含淀粉，可提取植物膠代阿拉伯膠。全草含石蒜堿、加蘭他敏等生物堿，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、降壓、抗炎、催吐、抗病毒、抗癌等作用［２］。

陜西漢中是石蒜的適生地，在當?shù)刈鳛橐环N民間藥材，已有悠久的使用歷史。但另一方面，石蒜的品種繁多，不同種中的有效成分含量不一，如何科學評價石蒜中的有效成分，是開發(fā)石蒜藥用價值的關(guān)鍵內(nèi)容之一。石蒜中加蘭他敏具有治老年癡呆癥的功效，目前其測定方法包括：分光光度法［３］、熒光分光光度法［４］、薄層掃描法及高效液相色譜法等［５－９］。本研究對石蒜中的加蘭他敏采用高效液相色譜法測定其含量，分析時間短，操作簡單，能夠有效測定石蒜中加蘭他敏的含量，將為開發(fā)石蒜的藥用價值提供基礎(chǔ)依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

石蒜樣品２００８年８月采于陜西省西鄉(xiāng)縣，經(jīng)８０℃烘干、粉碎，過６０目分樣篩，備用。

１．２儀器

高效液相色譜儀Ａｇｉｌｅｎｔ １１００（美國安捷倫公司）；ＳＫ－１２０Ｅ超聲波提取儀（寧波科生儀器有限公司）；ＵＶ－２５５０紫外－可見分光光度計（日本島津公司）；ＴＴＬ－１０Ａ超純水器（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展公司）；３０２型電熱恒溫鼓風干燥箱（山東濰紡醫(yī)藥集團股份有限公司醫(yī)療器械廠）；ＦＷ１１７型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；ＡＵＷ２２０Ｄ十萬分之一分析天平（日本島津公司）；ＦＡ２００４Ｎ萬分之一電子天平（上海分析儀器）；ＴＤ２４－低速臺式離心機（長沙湘儀器有限公司）；Ｇ８０Ｄ２３ＹＳ２－Ｑ６微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司）；電熱板（北京科偉永興儀器有限公司）。

１．３試劑

甲醇、氯仿、磷酸、氨水為分析純，乙腈為色譜純；加蘭他敏標準品（純度為９９．８％，ＳＩＧＭＡ公司）。實驗用水為純水儀制備的去離子水。

１．４方法

１．４．１檢驗波長選擇取加蘭他敏標準品適量，用去離子水配成標準溶液，在１９０～９００ ｎｍ之間掃描其吸收圖譜。

１．４．２色譜條件色譜柱：Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８柱（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）；檢測波長：２８９ ｎｍ；流動相：不同體積比的乙腈－０．２%磷酸梯度洗脫，即：０ ｍｉｎ（９７∶３）－５ ｍｉｎ（９０∶１０）－８ ｍｉｎ （８０∶２０）-１０ ｍｉｎ（９７∶３）；流速：１ ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫：２０ ℃。

１．４．３標準溶液的制備精密稱取５．０ ｍｇ加蘭他敏標準品，用去離子水溶解，定容于１０ ｍＬ容量瓶中。制得加蘭他敏標準品０．５ ｍｇ／ｍＬ的標準母液［１０］。

１．４．４線性范圍考察精密吸取加蘭他敏標準品母液０．２５、０．５、０．７５、１．０和１．２５ ｍＬ，用去離子水定容至５．０ ｍＬ容量瓶，制備不同濃度的加蘭他敏標準溶液，經(jīng)０．４５ μｍ微孔濾膜過濾，按上述色譜條件分別進樣１０ μＬ，測定標準溶液的峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合繪制標準曲線。

１．４．５樣品溶液的制備稱取干燥石蒜粉末１ ｇ于８０ ｍＬ燒杯中，加入２５ ｍＬ甲醇，在常壓下進行微波提取。間隔３０ ｓ后取出用冷水冷至室溫，然后重復微波提取，直至累計提取時間達１０ ｍｉｎ。待提取液冷至室溫后，以４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，取上清液于水?。担?℃蒸干，殘渣溶于５ ｍＬ ０．５ ｍｏｌ／Ｌ鹽酸，離心，取上清液，用氨水調(diào)ｐＨ值至１０，然后用氯仿萃取３次，每次１０ ｍＬ，合并氯仿液，水浴５０℃蒸干，殘渣用去離子水溶解并定容于５ ｍＬ容量瓶中［１１，１２］。過０．４５ μｍ微孔濾膜后進行色譜分析，同時進行精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及回收率實驗。

２結(jié)果與分析

２．１檢測波長

根據(jù)其紫外－可見吸收光譜，加蘭他敏標準品在２２４、２３２和２８９ ｎｍ處存在最大吸收光譜，參照早期研究［７－９］，本實驗選用２８９ ｎｍ為檢測波長。

２．２線性范圍

標樣色譜圖見圖１，根據(jù)不同濃度標準品的峰面積，計算得其線性回歸方程為：ｙ＝４６．２ｘ＋２９６．９，ｒ＝ ０．９９９ ８，表明加蘭他敏在０．２５～１．２５ μｇ范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

２．３精密度試驗

精密吸取上述供試樣品溶液１０ μＬ，連續(xù)進樣５次，測定加蘭他敏峰面積，得結(jié)果分別為４ ９０７、

４ ９５１、４ ９４６、４ ９１５、４ ９８８，ＲＳＤ為０．６５％（ｎ＝５）。

２．４穩(wěn)定性實驗

精密吸取上述供試樣品溶液１０ μＬ，分別在２、４、８、２４和４８ ｈ進樣測定加蘭他敏的峰面積，ＲＳＤ為１．０８％（ｎ＝５）。結(jié)果表明供試品溶液中的加蘭他敏在４８ ｈ內(nèi)穩(wěn)定。

２．５重現(xiàn)性實驗

取同一材料，按１．４．５的制備方法平行制備５份，依法測定加蘭他敏的峰面積，其ＲＳＤ值為１．４８％（ｎ＝５）。

２．６回收率試驗

分別稱取已知加蘭他敏含量的石蒜樣品１．０ ｇ，共５份，加入２５．００ μｇ／ｍＬ的加蘭他敏標準品１ ｍＬ，按１．４．５樣品溶液制備的方法操作，并做色譜分析。結(jié)果（表１）表明，加蘭他敏的平均回收率為１００．３％，ＲＳＤ值為０．３７％（ｎ＝５）。

２．７樣品材料測定結(jié)果

按上述供試液制備方法及色譜條件分別提取和測定３批石蒜樣品，利用外標峰面積法測定樣品中加蘭他敏的含量，結(jié)果見表２。

３討論

１）在本試驗中，我們首先考察了加蘭他敏的提取方法。采用６ ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸－３ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉提取法在過濾和蒸干時較為困難，提取率低，峰形較差，難以用于定量分析；而用甲醇提取時，也存在提取物峰形差的問題；經(jīng)過摸索，發(fā)現(xiàn)采用甲醇－氯仿法提取物的提取率高，重復性好，色譜峰形對稱，所以后續(xù)試驗采用該法進行提取。

２）在液相分析過程中，采用堿性流動相時，出峰時間在２０ ｍｉｎ之后，且峰形拖尾嚴重，峰形對稱性差，基線不易走平，而以乙腈∶水（２２∶７８，Ｖ／Ｖ），含１％（Ｖ／Ｖ）三乙胺，醋酸調(diào)ｐＨ值為７．０；或者磷酸鹽緩沖液（ｐＨ值為３～４）∶甲醇（體積比為９３∶７）以及體積比為２０∶８０的乙腈：水（含０．１％ＴＦＡ，Ｖ／Ｖ）等流動相進行洗脫時［１３］，保留時間在５ ｍｉｎ以內(nèi)，將目標物與雜質(zhì)分開。因此，最后選擇不同體積比的０．２%磷酸－乙腈梯度洗脫，即：０ ｍｉｎ（９７∶３）－５ ｍｉｎ（９０∶１０）－８ ｍｉｎ（８０∶２０）－１０ ｍｉｎ（９７∶３），并采用能耐受酸性環(huán)境的Ｅｅｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（５ μｍ，４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ）色譜柱，石蒜中各種成分分離較好，而且加蘭他敏的峰形較好，重復性好，能有效檢測石蒜中的加蘭他敏，為科學評價石蒜中的有效成分提供了分析依據(jù)。

參考文獻：

［１］ 張露，王光萍． 石蒜類植物無性繁殖技術(shù)［Ｊ］． 南京林業(yè)大學學報（自然科學版），２００２，２６（４）：１－５．

［２］ 鄧傳良，周堅． 石蒜屬植物生物堿研究概況［Ｊ］． 中國野生植物資源，２００４，２３（６）：１３－１４．

［３］ 方玲，葉銘龍． 紫外分光光度法測定氫溴酸加蘭他敏片的含量及含量均勻度［Ｊ］． 上海醫(yī)藥，１９９８，１９（９）：３５－３６．

［４］ 李霞，熊遠福，蔣利華，等． 熒光法測定石蒜中加蘭他敏含量［Ｊ］． 作物研究，２００６，２０（２）：１４９－１５０．

［５］ 李霞，熊遠福，蔣利華，等． 一步法測定加石蒜中加蘭他敏和石蒜堿含量［Ｊ］． 化工進展，２００８，２７（６）：９０４－９０７．

［６］ 靳朝東． 用ＨＰＬＣ法快速測定石蒜科植物中的加蘭他敏［Ｊ］． 國外醫(yī)藥（植物藥分冊），２００５（１）：１６．

［７］ 范華均，染偉，李攻科． 微波輔助提取／ＨＰＬＣ分析石蒜中的生物堿［Ｊ］． 分析測試學報， ２００６，２５（３）：２７－３０．

［８］ ＡＢＤＡＬＬＡＨ Ｏ Ｍ．Ｍｉｎｏｒ aｌｋａｌｏｉｄｓ fｒｏｍ lｙｃｏｒ ｉｓ sａｎｇｕｉｎｅａ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，ｌ３９：４７７－４７８．

［９］ 吳芳麗，李愛珍，毛慧芳． ＨＰＬＣ測定石蒜中加蘭他敏含量［Ｊ］． 中國中藥雜志，２００５，３０（７）：５２３－５２５．

［１０］ 江海，吳三橋，李新生．利用ＨＰＬＣ法測定狼牙刺種子氧化苦參堿含量［Ｊ］． 江蘇農(nóng)業(yè)科學，２００８（６）：２４５－２４６．

［１１］ 王曉燕，黃敏仁，韓正敏．微波輔助提取石蒜屬植物忽地笑中加蘭他敏的研究［Ｊ］．南京中醫(yī)藥大學學報，２００５，２１（６）：３７４－３７５．

［１２］ ＫＩＴＡ Ｙ，ＧＹＯＴＥＮ Ｍ，ＮＡＫＡＪＩＭＡ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｐｅｒｖａｌｅｎｔ ｉｏｄｉｎｅ（ＩＩＩ） ｒｅａｇｅｎｔ： Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ－ｔｙｐｅ ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ ａｌｋａｌｏｉｄｓ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，６３（１９）：６６２５－６６３３．

［１３］ 王曉燕，黃敏仁，韓正敏． 石蒜屬植物中加蘭他敏的分離提取及其應用［Ｊ］． 南京林業(yè)大學學報，２００４，２８（４）：７９－８３．