江海 曹小勇 吳三橋等

摘要：建立了測(cè)定石蒜中加蘭他敏含量的高效液相色譜法。以梯度乙腈－０．２%磷酸為流動(dòng)相，Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）為固定相，流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ，柱溫為２０ ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為２８９ ｎｍ，對(duì)加蘭他敏進(jìn)行分析。結(jié)果表明，加蘭他敏在該色譜條件下與其他組分均能有效分離，符合分析條件。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；加蘭他敏；石蒜；含量

中圖分類號(hào)：Ｏ６５７．７＋２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）16－3389-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ ｉｎ Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ ｂｙ ＨＰＬＣ

ＪＩＡＮＧ Ｈａｉ１，２，ＣＡＯ Ｘｉａｏ－ｙｏｎｇ２，ＷＵ Ｓａｎ－ｑｉａｏ１，ＬＩ Ｘｉｎ－ｓｈｅｎｇ１，ＬＩ Ｚｉ－ｘｕａｎ２，ＷＡＮＧ Ｙｕ－ｔｉｎｇ２

（１． Ｓｈａａｎｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅ， Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｇａｌａｎｔhａｍｉｎｅ ｉｎ Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（１５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅ ｗｉｔｈ ａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ａｎｄ ０．２％ Ｈ３ＰＯ４ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １ ｍＬ／ｍｉｎ ａｔ ２０ ℃， ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ２８９ ｎｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｇｏｏｄ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＨＰＬＣ； ｇａｌａｎｔhａｍｉｎｅ； Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ； ｃｏｎｔｅｎｔ

石蒜（Ｌｙｃｏｒｉｓ ｒａｄｉａｔａ）別名老鴉蒜，龍爪花，屬于石蒜科石蒜屬，多年生草本，葉帶狀，深綠色帶白霜粉，分布于長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)，喜生于林緣、河岸陰濕處［１］。該屬植物花朵色澤鮮艷，其品種眾多，有紅花、粉紅花、黃花、淡紅紫色、百合型、白長(zhǎng)筒型等，形態(tài)別致，是一種具鱗莖的花卉植物，具有良好的觀賞價(jià)值。石蒜鱗莖含淀粉，可提取植物膠代阿拉伯膠。全草含石蒜堿、加蘭他敏等生物堿，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、降壓、抗炎、催吐、抗病毒、抗癌等作用［２］。

陜西漢中是石蒜的適生地，在當(dāng)?shù)刈鳛橐环N民間藥材，已有悠久的使用歷史。但另一方面，石蒜的品種繁多，不同種中的有效成分含量不一，如何科學(xué)評(píng)價(jià)石蒜中的有效成分，是開發(fā)石蒜藥用價(jià)值的關(guān)鍵內(nèi)容之一。石蒜中加蘭他敏具有治老年癡呆癥的功效，目前其測(cè)定方法包括：分光光度法［３］、熒光分光光度法［４］、薄層掃描法及高效液相色譜法等［５－９］。本研究對(duì)石蒜中的加蘭他敏采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，分析時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，能夠有效測(cè)定石蒜中加蘭他敏的含量，將為開發(fā)石蒜的藥用價(jià)值提供基礎(chǔ)依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

石蒜樣品２００８年８月采于陜西省西鄉(xiāng)縣，經(jīng)８０℃烘干、粉碎，過(guò)６０目分樣篩，備用。

１．２儀器

高效液相色譜儀Ａｇｉｌｅｎｔ １１００（美國(guó)安捷倫公司）；ＳＫ－１２０Ｅ超聲波提取儀（寧波科生儀器有限公司）；ＵＶ－２５５０紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；ＴＴＬ－１０Ａ超純水器（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展公司）；３０２型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（山東濰紡醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司醫(yī)療器械廠）；ＦＷ１１７型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；ＡＵＷ２２０Ｄ十萬(wàn)分之一分析天平（日本島津公司）；ＦＡ２００４Ｎ萬(wàn)分之一電子天平（上海分析儀器）；ＴＤ２４－低速臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀器有限公司）；Ｇ８０Ｄ２３ＹＳ２－Ｑ６微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司）；電熱板（北京科偉永興儀器有限公司）。

１．３試劑

甲醇、氯仿、磷酸、氨水為分析純，乙腈為色譜純；加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品（純度為９９．８％，ＳＩＧＭＡ公司）。實(shí)驗(yàn)用水為純水儀制備的去離子水。

１．４方法

１．４．１檢驗(yàn)波長(zhǎng)選擇取加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品適量，用去離子水配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，在１９０～９００ ｎｍ之間掃描其吸收?qǐng)D譜。

１．４．２色譜條件色譜柱：Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８柱（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）；檢測(cè)波長(zhǎng)：２８９ ｎｍ；流動(dòng)相：不同體積比的乙腈－０．２%磷酸梯度洗脫，即：０ ｍｉｎ（９７∶３）－５ ｍｉｎ（９０∶１０）－８ ｍｉｎ （８０∶２０）-１０ ｍｉｎ（９７∶３）；流速：１ ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫：２０ ℃。

１．４．３標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱?。担?ｍｇ加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解，定容于１０ ｍＬ容量瓶中。制得加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品０．５ ｍｇ／ｍＬ的標(biāo)準(zhǔn)母液［１０］。

１．４．４線性范圍考察精密吸取加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品母液０．２５、０．５、０．７５、１．０和１．２５ ｍＬ，用去離子水定容至５．０ ｍＬ容量瓶，制備不同濃度的加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)０．４５ μｍ微孔濾膜過(guò)濾，按上述色譜條件分別進(jìn)樣１０ μＬ，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

１．４．５樣品溶液的制備稱取干燥石蒜粉末１ ｇ于８０ ｍＬ燒杯中，加入２５ ｍＬ甲醇，在常壓下進(jìn)行微波提取。間隔３０ ｓ后取出用冷水冷至室溫，然后重復(fù)微波提取，直至累計(jì)提取時(shí)間達(dá)１０ ｍｉｎ。待提取液冷至室溫后，以４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，取上清液于水?。担?℃蒸干，殘?jiān)苡冢?ｍＬ ０．５ ｍｏｌ／Ｌ鹽酸，離心，取上清液，用氨水調(diào)ｐＨ值至１０，然后用氯仿萃?。炒?，每次１０ ｍＬ，合并氯仿液，水?。担啊嬲舾桑瑲?jiān)萌ルx子水溶解并定容于５ ｍＬ容量瓶中［１１，１２］。過(guò)０．４５ μｍ微孔濾膜后進(jìn)行色譜分析，同時(shí)進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及回收率實(shí)驗(yàn)。

２結(jié)果與分析

２．１檢測(cè)波長(zhǎng)

根據(jù)其紫外－可見(jiàn)吸收光譜，加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品在２２４、２３２和２８９ ｎｍ處存在最大吸收光譜，參照早期研究［７－９］，本實(shí)驗(yàn)選用２８９ ｎｍ為檢測(cè)波長(zhǎng)。

２．２線性范圍

標(biāo)樣色譜圖見(jiàn)圖１，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，計(jì)算得其線性回歸方程為：ｙ＝４６．２ｘ＋２９６．９，ｒ＝ ０．９９９ ８，表明加蘭他敏在０．２５～１．２５ μｇ范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

２．３精密度試驗(yàn)

精密吸取上述供試樣品溶液１０ μＬ，連續(xù)進(jìn)樣５次，測(cè)定加蘭他敏峰面積，得結(jié)果分別為４ ９０７、

４ ９５１、４ ９４６、４ ９１５、４ ９８８，ＲＳＤ為０．６５％（ｎ＝５）。

２．４穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述供試樣品溶液１０ μＬ，分別在２、４、８、２４和４８ ｈ進(jìn)樣測(cè)定加蘭他敏的峰面積，ＲＳＤ為１．０８％（ｎ＝５）。結(jié)果表明供試品溶液中的加蘭他敏在４８ ｈ內(nèi)穩(wěn)定。

２．５重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一材料，按１．４．５的制備方法平行制備５份，依法測(cè)定加蘭他敏的峰面積，其ＲＳＤ值為１．４８％（ｎ＝５）。

２．６回收率試驗(yàn)

分別稱取已知加蘭他敏含量的石蒜樣品１．０ ｇ，共５份，加入２５．００ μｇ／ｍＬ的加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品１ ｍＬ，按１．４．５樣品溶液制備的方法操作，并做色譜分析。結(jié)果（表１）表明，加蘭他敏的平均回收率為１００．３％，ＲＳＤ值為０．３７％（ｎ＝５）。

２．７樣品材料測(cè)定結(jié)果

按上述供試液制備方法及色譜條件分別提取和測(cè)定３批石蒜樣品，利用外標(biāo)峰面積法測(cè)定樣品中加蘭他敏的含量，結(jié)果見(jiàn)表２。

３討論

１）在本試驗(yàn)中，我們首先考察了加蘭他敏的提取方法。采用６ ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸－３ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉提取法在過(guò)濾和蒸干時(shí)較為困難，提取率低，峰形較差，難以用于定量分析；而用甲醇提取時(shí)，也存在提取物峰形差的問(wèn)題；經(jīng)過(guò)摸索，發(fā)現(xiàn)采用甲醇－氯仿法提取物的提取率高，重復(fù)性好，色譜峰形對(duì)稱，所以后續(xù)試驗(yàn)采用該法進(jìn)行提取。

２）在液相分析過(guò)程中，采用堿性流動(dòng)相時(shí)，出峰時(shí)間在２０ ｍｉｎ之后，且峰形拖尾嚴(yán)重，峰形對(duì)稱性差，基線不易走平，而以乙腈∶水（２２∶７８，Ｖ／Ｖ），含１％（Ｖ／Ｖ）三乙胺，醋酸調(diào)ｐＨ值為７．０；或者磷酸鹽緩沖液（ｐＨ值為３～４）∶甲醇（體積比為９３∶７）以及體積比為２０∶８０的乙腈：水（含０．１％ＴＦＡ，Ｖ／Ｖ）等流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)［１３］，保留時(shí)間在５ ｍｉｎ以內(nèi)，將目標(biāo)物與雜質(zhì)分開。因此，最后選擇不同體積比的０．２%磷酸－乙腈梯度洗脫，即：０ ｍｉｎ（９７∶３）－５ ｍｉｎ（９０∶１０）－８ ｍｉｎ（８０∶２０）－１０ ｍｉｎ（９７∶３），并采用能耐受酸性環(huán)境的Ｅｅｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（５ μｍ，４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ）色譜柱，石蒜中各種成分分離較好，而且加蘭他敏的峰形較好，重復(fù)性好，能有效檢測(cè)石蒜中的加蘭他敏，為科學(xué)評(píng)價(jià)石蒜中的有效成分提供了分析依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 張露，王光萍． 石蒜類植物無(wú)性繁殖技術(shù)［Ｊ］． 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００２，２６（４）：１－５．

［２］ 鄧傳良，周堅(jiān)． 石蒜屬植物生物堿研究概況［Ｊ］． 中國(guó)野生植物資源，２００４，２３（６）：１３－１４．

［３］ 方玲，葉銘龍． 紫外分光光度法測(cè)定氫溴酸加蘭他敏片的含量及含量均勻度［Ｊ］． 上海醫(yī)藥，１９９８，１９（９）：３５－３６．

［４］ 李霞，熊遠(yuǎn)福，蔣利華，等． 熒光法測(cè)定石蒜中加蘭他敏含量［Ｊ］． 作物研究，２００６，２０（２）：１４９－１５０．

［５］ 李霞，熊遠(yuǎn)福，蔣利華，等． 一步法測(cè)定加石蒜中加蘭他敏和石蒜堿含量［Ｊ］． 化工進(jìn)展，２００８，２７（６）：９０４－９０７．

［６］ 靳朝東． 用ＨＰＬＣ法快速測(cè)定石蒜科植物中的加蘭他敏［Ｊ］． 國(guó)外醫(yī)藥（植物藥分冊(cè)），２００５（１）：１６．

［７］ 范華均，染偉，李攻科． 微波輔助提取／ＨＰＬＣ分析石蒜中的生物堿［Ｊ］． 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， ２００６，２５（３）：２７－３０．

［８］ ＡＢＤＡＬＬＡＨ Ｏ Ｍ．Ｍｉｎｏｒ aｌｋａｌｏｉｄｓ fｒｏｍ lｙｃｏｒ ｉｓ sａｎｇｕｉｎｅａ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，ｌ３９：４７７－４７８．

［９］ 吳芳麗，李愛(ài)珍，毛慧芳． ＨＰＬＣ測(cè)定石蒜中加蘭他敏含量［Ｊ］． 中國(guó)中藥雜志，２００５，３０（７）：５２３－５２５．

［１０］ 江海，吳三橋，李新生．利用ＨＰＬＣ法測(cè)定狼牙刺種子氧化苦參堿含量［Ｊ］． 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００８（６）：２４５－２４６．

［１１］ 王曉燕，黃敏仁，韓正敏．微波輔助提取石蒜屬植物忽地笑中加蘭他敏的研究［Ｊ］．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，２００５，２１（６）：３７４－３７５．

［１２］ ＫＩＴＡ Ｙ，ＧＹＯＴＥＮ Ｍ，ＮＡＫＡＪＩＭＡ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｐｅｒｖａｌｅｎｔ ｉｏｄｉｎｅ（ＩＩＩ） ｒｅａｇｅｎｔ： Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ－ｔｙｐｅ ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ ａｌｋａｌｏｉｄｓ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，６３（１９）：６６２５－６６３３．

［１３］ 王曉燕，黃敏仁，韓正敏． 石蒜屬植物中加蘭他敏的分離提取及其應(yīng)用［Ｊ］． 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００４，２８（４）：７９－８３．