耿明江 范秉琳 李琴等

摘要：測定了木槿花醇溶性色素在可見光區(qū)的最大吸收波長；在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗，以吸光度與浸提液總體積之積為指標(biāo)，對提取溫度、浸提時間、超聲時間和料液比進(jìn)行優(yōu)選研究，采用鄰苯三酚自氧化法考察該色素清除超氧自由基活性。結(jié)果顯示最佳提取工藝條件為提取溫度40℃，料液比1∶50（W/V，g∶mL），浸提時間1 h（包括超聲時間45 min）；該色素具有一定的清除超氧自由基活性。

關(guān)鍵詞：木槿花；醇溶性色素；正交試驗；超氧自由基

中圖分類號：Ｓ６８５．９９ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）16－3378-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｔｈａｎｏｌ－ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｓｃａｖｅｎｇｅ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.

ＧＥＮＧ Ｍｉｎｇ－ｊｉａｎｇ１，ＦＡＮ Ｂｉｎｇ－ｌｉｎ１，ＬＩ Ｑｉｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｈｕａｉ－ｋｕｎ３

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ of Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Henan， Ｃｈｉｎａ； ２．Ａｎａｌｙｓｉｓ ＆ Ｔｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Henan， Ｃｈｉｎａ； ３．Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｗｅｉｈｕｉ ４５３１００，Henan， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ. ｗａｓ ｍｅｎｓｕｒａｔｅｄ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ （Ａ·Ｖ）， ａｍｏｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ temperature， ｓｏａｋｉｎｇ ｔｉｍｅ， ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｍａｔｅｒｉａｌ－ｓｏｌｖｅｎｔ ｒａｔｉｏ． Ｔｈｅ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｃａｖｅｎｇｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ was extracting temperature 40 ℃， material-solvent ratio 1∶50（W/V，g∶mL）， soaking time 1h（including ultrasonic time 45 min）， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｈａｓ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｃａｖｅｎｇｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.； ｅｔｈａｎｏｌ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ

木槿（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ Ｌ.）屬于錦葵科木槿屬落葉喬木，夏季滿枝綴花，花朵大而艷麗，花、葉對ＳＯ２、ＮＯｘ具有較強的吸收性和耐受性［１］，因而被廣泛用作庭院、街道的綠化植物。此外，木槿還是一種重要的藥用植物，其根、皮、花、種子皆可入藥［２，３］。Ｋｗｏｎ等［４］考察了熱處理對木槿枝、根醇提取物抗氧化活性的影響。金月亭等［５］證實木槿花的乙醇研磨液具有一定的抑菌、促進(jìn)凝血的活性。景立新等［６］從營養(yǎng)價值的角度對木槿花進(jìn)行了研究。蔣新龍的研究小組先后對木槿花中的總黃酮［７］、紅色素［８］的提取工藝進(jìn)行了探討。本試驗以干燥粉碎的重瓣紫色木槿花花瓣為原料，對木槿花醇溶性色素的提取工藝及其清除超氧自由基活性進(jìn)行研究，以期為木槿花色素的研究開發(fā)提供依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１木槿花木槿花于２０１０年８月采摘于河南省新鄉(xiāng)市新中大道，花瓣經(jīng)３５～４０ ℃鼓風(fēng)干燥４８ ｈ，粉碎后避光保存?zhèn)溆谩?/p>

１．１．２試劑維生素Ｃ，美國Sｉｇｍａ公司，其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純，使用前未進(jìn)行任何純化處理。除自由基活性測試過程中用水為二次蒸餾水外，其他檢測用水均為去離子水。８６００２１大孔吸附樹脂，山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司，使用前按說明書所示方法進(jìn)行活化處理。

１．１．３儀器島津ＵＶ２５５０紫外可見分光光度計，ＳＥＮＣＯ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，１０１－３型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，Ｓａｒｔｏｕｒｕｓ ＢＳ２４４ 電子分析天平，ＫＱ－１００ＤＢ型超聲波清洗器，多功能粉碎機，恒溫水浴鍋，雷磁ＰＨＳ－３Ｂ型酸度計。

１．２方法

１．２．１色素的提取準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的木槿花瓣粉末于５０ ｍＬ具塞三角瓶中，加入溶劑，按一定的水浴溫度、超聲時間、浸提時間和料液比進(jìn)行提取，冷卻后過濾；然后向濾液中加入一定體積的９５％乙醇，使終體積分?jǐn)?shù)約為８０％，將此液體以

４ ０００ ｒ／ｍｉｎ的速度離心５ ｍｉｎ，棄去沉淀，上清液經(jīng)減壓濃縮后得粗色素浸膏。

１．２．２色素的精制向色素浸膏中加入少量水，超聲分散后，石油醚萃?。泊危凰嗌希福叮埃埃玻贝罂孜綐渲?，先用４倍柱體積的水洗后，再用９５％乙醇進(jìn)行洗脫；將洗脫液減壓蒸去乙醇，得紫黑色色素粉末。

１．２．３色素吸收光譜的測定取適量精制的色素粉末，用５０％乙醇溶解后得紅色溶液。以等體積分?jǐn)?shù)乙醇為參比，將此溶液在３００～８００ ｎｍ的波長范圍內(nèi)掃描，得其吸收曲線。

１．２．４單因素試驗影響色素得率的因素較多，本試驗主要從浸提溫度、時間、超聲時間和料液比等方面進(jìn)行單因素試驗。浸提溫度選?。玻?、３０、４０、５０、６０℃ ５個水平，提取時間選?。?、２、３、４、５ ｈ ５個水平，超聲時間選?。?、１５、３０、４５、６０ ｍｉｎ ５個水平，料液比選?。薄茫常啊ⅲ薄茫矗?、１∶５０、１∶６０、１∶７０（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同）５個水平，分別進(jìn)行試驗。

１．２．５正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，以提取液的吸光度（Ａ）與浸提液的總體積（V）之積為得率考察指標(biāo)，采用Ｌ９（３４）正交表進(jìn)行正交試驗，因素與水平設(shè)計見表１。試驗結(jié)果利用Ｏｒｉｇｉｎ ７．５進(jìn)行方差分析，篩選出提取醇溶性色素的最佳條件，并對所得的最佳條件進(jìn)行驗證試驗。

１．２．６體外清除超氧自由基活性試驗根據(jù)許申鴻等［９］所述方法稍加改變。在４ ｍＬ反應(yīng)混合物中含有Ｔｒｉs－ＨＣｌ緩沖溶液（ｐＨ值為８．２）３．４ ｍＬ、２０

ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ水溶液０．２ ｍＬ、不同含量的精制色素水溶液０．２ ｍＬ、５ ｍｍｏｌ／Ｌ的鄰苯三酚０．２ ｍＬ。先將混合物于２５℃保溫２０ ｍｉｎ， 再加入等溫的鄰苯三酚溶液；加入后立即搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)４ ｍｉｎ，立即在４２０ ｎｍ波長處測定其吸光度Ａｉ。同時設(shè)立自身組（Ａｉ′）和控制組（Ａ０），分別以等體積的水代替鄰苯三酚或色素，并以維生素Ｃ為正的對照試驗。清除率（％）＝［１－（Ａｉ＋Ａｉ′）／Ａ０］×１００。

２結(jié)果與分析

２．１木槿花醇溶性色素的光譜特征

從圖１可知醇溶性色素在可見光區(qū)內(nèi)有一個較明顯的吸收，其最大吸收峰位于５３４ ｎｍ處。故本試驗均以５３４ ｎｍ作為檢測波長。

２．２單因素試驗

將０．５ ｇ木槿花瓣粉末分別溶于一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇中，控制其他因素，考察改變某單一因素時對醇溶性色素A·V值的影響（圖２）。由圖２可知，當(dāng)料液比為１∶４０、超聲預(yù)處理３０ ｍｉｎ、浸提時間為２ ｈ時，醇溶性色素的A·V值在２０～６０ ℃范圍內(nèi)隨著提取溫度的升高，A·V值相應(yīng)增大；當(dāng)溫度超過５０ ℃時，溫度對色素A·V值的影響變小，因此以５０ ℃為提取溫度較為合適。當(dāng)固定料液比１∶４０、超聲預(yù)處理３０ ｍｉｎ、（５０±１）℃恒溫條件下，改變浸提時間，醇溶性色素的A·V值隨浸提時間的增加而增大；但當(dāng)浸提時間達(dá)到３ ｈ后，浸提時間的延長對色素A·V值的影響不大。當(dāng)固定料液比１∶４０、５０ ℃恒溫、浸提時間共計２ ｈ時，超聲處理時間對醇溶性色素的A·V值影響較為明顯，并且隨著超聲處理時間的延長，色素的A·V值會相應(yīng)增加；但當(dāng)超過４５ ｍｉｎ后，增幅變緩。當(dāng)超聲預(yù)處理３０ ｍｉｎ、總提取時間為２ ｈ、提取溫度保持在（５０±１）℃時，隨料液比的改變色素的A·V值發(fā)生相應(yīng)的變化，考慮到料液比過大會使后面的沉淀、離心、濃縮等工作量增大，且耗費更多的乙醇和熱能，因此料液比為１∶４０～１∶６０較為合適。

２．３正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對上述各因素選定３個水平，以浸提液的吸光度（Ａ）與浸提液的總體積（Ｖ）之積（Ａ·Ｖ）為得率考察指標(biāo)，設(shè)計正交試驗。其正交試驗結(jié)果見表２。由表２結(jié)果可知，Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，即影響木槿花色素提取效果的各因素主次順序為：超聲時間＞料液比＞提取溫度＞浸提時間。

由方差分析結(jié)果可知，除浸提時間外，其他各因素均對色素的提取效果有顯著性差異。根據(jù)表２可知最佳工藝條件為Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２，但考慮到在４０、５０ ℃時提取效果增加不明顯，而溫度越高所消耗的能源就越多，從節(jié)約能源角度綜合考慮，提取色素最佳工藝條件定為Ａ３Ｂ１Ｃ2Ｄ２，即在４０ ℃條件下，按

１∶５０的料液比混合后先超聲處理４５ ｍｉｎ，然后再浸取1５ ｍｉｎ。

２．４驗證試驗

準(zhǔn)確稱?。埃?ｇ干燥木槿花花瓣粉末，按上述所得最佳工藝條件進(jìn)行驗證試驗，醇溶性色素的A·V值分別為１３．５５０、１３．６００、１３．４７５，平均A·V值為１３．５４２。

２．5木槿花色素對超氧自由基的清除作用

從表３可以看出，木槿花色素具有一定的清除超氧自由基活性，并且這種活性隨著色素濃度的升高而增強，表明它們間存在一定的量效關(guān)系。但對比ＶC的清除活性可知，在等濃度條件下該色素活性比ＶC要弱得多，色素對超氧自由基清除率達(dá)５０％時所需濃度（ＥＣ５０）大于１０ ｇ／Ｌ（清除率為４０．３％），而ＶC的ＥＣ５０小于０．４ ｇ／Ｌ（消除率為６７．８％）。因此該色素并不是一種很強的清除超氧自由基活性物質(zhì)。

３結(jié)論

影響木槿花色素得率的因素依次為：超聲時間、料液比、提取溫度和浸提時間，最佳提取工藝條件是：溫度４０℃、料液比１∶５０、提取時間1 ｈ（包括超聲處理４５ ｍｉｎ）。3次平行驗證試驗間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為０．４３３％，說明該工藝條件穩(wěn)定可行。木槿花色素具有一定清除超氧自由基的活性，并且其清除能力與濃度存在量效關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

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