王凱 王青

摘要：研究酶法提取寧夏沙棗（Ｅｌａｅａｇｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ Ｌ．）中多糖的提取工藝。在單因素試驗的基礎上，采用正交設計考察了不同ｐＨ值、酶的添加量、酸提時間對多糖提取率的影響。結果表明，最佳工藝條件為酶提ｐＨ值４．３８，添加酶的質量分數(shù)５％，酶提時間３ ｈ，酶提溫度６０ ℃。最佳條件下多糖的提取率為72.93％。

關鍵詞：寧夏沙棗；多糖；提取工藝；正交試驗

中圖分類號：Ｓ６６５．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）16－3368-03

Study on Enzymatic Extracting Conditions of Polysaccharide from

Elaeagnus angustifolia L. in Ningxia

ＷＡＮＧ Ｋａｉ１，ＷＡＮＧ Ｑｉｎｇ２

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｅｉｆａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｈａｎｇｑｉｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｓｈａｎｇｑｉｕ ４７６１００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ eｎｚｙｍａｔｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｅｌａｅａｇｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ L. ｉｎ Ｎｉｎｇｘｉａ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ， ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓａｇｅ， ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｅ． ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ｐＨ ４．３８， ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓａｇｅ ５％，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ３ ｈ， ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ６０ ℃． Ｕｎｄｅｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ 72.93％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｌａｅａｇｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ L.； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ

沙棗（Ｅｌａｅａｇｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ Ｌ．）又名銀柳、香柳、桂香柳、七里香、紅豆等，為胡頹子科胡頹子屬落葉（或常綠）喬木或灌木［１］。主要分布在我國華北、西北等省區(qū)，且以西北荒漠、半荒漠地區(qū)為分布中心［２］。沙棗多糖在抗腫瘤、消炎、抗病毒、降血糖、降血脂、抗衰老、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等方面有生物活性作用［３］。廉宜君等［４］對新疆的沙棗多糖的提取進行了研究，但寧夏本地產(chǎn)沙棗多糖的提取尚無報道。該試驗采用正交試驗對寧夏沙棗多糖的酶法提取工藝進行研究，為制定更加經(jīng)濟的沙棗多糖提取工藝提供試驗依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

７２２Ｓ型分光光度計、ＰＨＳ－３Ｃ型精密ｐＨ計、ＦＡ１００４Ｎ型電子分析天平、ＪＹ３００２型電子天平（均購自上海精密科學儀器有限公司）；ＫＡ－１０００型離心機（上海安亭科學儀器廠）；１０１型電熱鼓風干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司）。

沙棗，采于寧夏回族自治區(qū)銀川市西夏區(qū)同心南路，６０℃干燥，磨碎，４０目過篩，制成沙棗粉；果膠酶（北京化工廠）、醋酸、醋酸鈉、葡萄糖、濃硫酸、苯酚均為國產(chǎn)分析純。

１．２方法

１．２．１標準曲線的繪制①苯酚的配制。稱取一定量的苯酚固體，４５ ℃溶解為液體，加入１００ ｍＬ的圓底燒瓶中，再加０．０２ ｇ的鋁片和０．０５ ｇ碳酸氫鈉，常壓蒸餾收集１８０～１８２ ℃餾分，得白色針狀苯酚結晶。加一定體積去離子水溶解，配成質量分數(shù)為５％的苯酚溶液，避光貯藏備用。②標準葡萄糖溶液的配制。精密稱?。叮?℃干燥至恒重的葡萄糖０．１００ ０ ｇ，用去離子水溶解并定容在１００ ｍＬ的容量瓶中，配制成濃度為１．０００ ０ ｍｇ／mＬ的標準葡萄糖溶液。③標準曲線的繪制。準確移取０．００、０．４０、０．８０、１．２０、１．６０、２．００、２．４０、２．８０ ｍＬ １．０００ ０ ｍｇ／ｍＬ標準葡萄糖溶液于１００ ｍＬ的容量瓶中，去離子水定容，搖勻。再分別精密移取上述８種濃度的溶液２．００ ｍＬ于１０ ｍＬ的具塞刻度試管中，加５％（m/m，下同）的苯酚溶液１．００ ｍＬ，混勻，再加濃硫酸５．００ ｍＬ，４０ ℃的水浴中恒溫３０ ｍｉｎ，然后立即轉移至冰水浴中冷卻３０ ｍｉｎ，用試劑空白作參比，于４９０ ｎｍ波長處測定吸光度［５］，結果見表１。標準曲線的回歸方程為：

Ａ＝６２．２２６ ０Ｃ－０．００１ ２，ｒ＝０．９９９ ７。標準曲線在０．０００～０．００７ ｍｇ／ｍＬ范圍內(nèi)線性良好。

１．２．２多糖提取工藝流程沙棗→６０ ℃烘干→去核→粉碎→熱水浸提３０ ｍｉｎ→酶提→滅酶（８０ ℃，１ ｈ）→離心分離６ ｍｉｎ→稀釋，定容→苯酚－硫酸法測吸光度。

１．２．３多糖含量的測定稱０．５０ ｇ沙棗粉于５０ ｍＬ的具塞三角瓶，加去離子水１０ ｍＬ，搖勻，８０ ℃恒溫３０ ｍｉｎ，冷卻至室溫，加入用緩沖溶液定容的果膠酶，５０ ℃水浴中恒溫２ ｈ，然后８０ ℃恒溫１ ｈ滅酶，離心得樣品液，準確移取上清液０．１０ ｍＬ，定容至１００ ｍＬ的容量瓶中，再移取該液２．００ ｍＬ于１０ ｍＬ具塞刻度試管中，先加５％的苯酚溶液１．００ ｍＬ，混勻后加入濃硫酸５．００ ｍＬ。在４０ ℃水浴中恒溫３０ ｍｉｎ，冰水浴中冷卻３０ ｍｉｎ，以試劑空白做參比，測定其吸光度。用標準曲線計算多糖含量。多糖的提取率＝多糖的濃度／棗粉的濃度×１００％。

１．２．４酶種類的選取根據(jù)其他植物多糖提取累積的經(jīng)驗，選取果膠酶、纖維素酶及其兩者的復合酶為參考因素，確定酶的種類。為了保證試驗的準確性，做３次平行試驗，結果都顯示果膠酶的作用大于纖維素酶和復合酶，因此試驗采用果膠酶。表２為３次試驗結果的平均值。

２結果與分析

２．１單因素試驗結果

２．１．１ｐＨ值對沙棗多糖提取率的影響適當?shù)模穑戎迪?，靜電作用維持了酶活性中心的最佳三維構象，促進了酶和底物的結合；ｐＨ值不同，酶與底物所帶電荷不同，酶的立體構象以及酶與底物的親和力不同，催化速度也就不同。稱取沙棗粉０．５０ ｇ，加去離子水１０ ｍＬ，搖勻，８０ ℃恒溫３０ ｍｉｎ，冷卻至室溫，準確移取用ｐＨ值為３．４０、３．８１、４．３８、４．９２的緩沖溶液配制的質量分數(shù)為２％的果膠酶５．００ ｍＬ，酶提溫度５０℃、酶提時間２ ｈ條件下，按1.２．３的方法操作，研究不同ｐＨ值對沙棗多糖提取率的影響。結果見表３。由表可見，開始時隨著ｐＨ值的增大，提取率也在增大；在ｐＨ值為３．８１時，提取率最大，為６３．６７％；隨著ｐＨ值的繼續(xù)增大，提取率開始下降，所以ｐＨ值選?。常福薄?/p>

２．１．２酶的添加量對沙棗多糖提取率的影響生化反應中，在底物濃度相同條件下，酶促反應速度與酶的初始濃度成正比。但即使酶濃度足夠高，隨底物濃度的升高，酶促反應速度并沒有因此增加，反而受到抑制。稱取沙棗粉０．５０ ｇ，加去離子水１０ ｍＬ，搖勻，８０ ℃恒溫３０ ｍｉｎ，冷卻至室溫，再準確移?。穑戎禐椋常福钡木彌_溶液配制的質量分數(shù)為２％、３％、４％、５％的果膠酶５．００ ｍＬ，酶提溫度５０ ℃、酶提時間２ ｈ條件下，按1.２．３的方法操作研究不同酶的添加量對沙棗多糖提取率的影響，結果見表４。由表可知，在酶的添加量為４％時提取率最大，為６９．０７％，但隨著酶的添加量的繼續(xù)增大，提取率開始出現(xiàn)下降。所以，酶的添加量選４％。

２．１．３酶提溫度對沙棗多糖提取率的影響各種酶的活性都有合適的溫度范圍，溫度過高或過低都會降低酶的催化效率，即降低酶促反應速度。溫度太高，酶會被破壞，酶的催化作用完全喪失。稱取沙棗粉０．５０ ｇ，加去離子水１０ ｍＬ，搖勻，８０ ℃恒溫３０ ｍｉｎ，冷卻至室溫，再準確移取ｐＨ值為３．８１的緩沖溶液配制的質量分數(shù)為４％的果膠酶５．００ ｍＬ，酶提溫度分別為４０、５０、６０、７０ ℃，酶提時間為２ ｈ，按1.２．３方法操作，研究不同酶提溫度對沙棗多糖提取率的影響，結果見表５。由表5可知，隨著酶提溫度上升，酶的活性也在上升，提取率也隨之增大。在６０ ℃時出現(xiàn)最大值，說明此時酶達到最大活性，多糖提取率最大，達６２．９１％。隨著酶提溫度的繼續(xù)升高，酶的活性開始下降，提取率也隨之減小。所以酶提溫度選６０ ℃。

２．１．４酶提時間對沙棗多糖提取率的影響酶作用的時間和酶所反應的程度有密切的關系，如果反應的時間太短，則酶作用的不充分，而當酶作用的程度達到一定值時，提取率也不會隨著酶提時間的延長而增大。稱取沙棗粉０．５０ ｇ，加去離子水１０ ｍＬ，搖勻，８０ ℃恒溫３０ ｍｉｎ，冷卻至室溫，再準確移取ｐＨ值為３．８１的緩沖溶液配制的質量分數(shù)為４％的果膠酶５．００ ｍＬ，酶提溫度為６０ ℃，酶提時間分別為１、２、３、４ ｈ，按1.２．３方法操作，研究不同酶提時間對沙棗多糖提取率的影響，結果見表６。由表6可知，在酶提時間為３ ｈ時，提取率為６３．０９％，達最大。而后隨著酶提時間增長，提取率開始下降。所以酶提時間選３ ｈ。

２．２正交試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，以沙棗多糖提取率為指標，選擇ｐＨ值、酶的添加量、酶提時間３個因素，每個因素選取３個水平，采用Ｌ９（３４）正交試驗優(yōu)選沙棗多糖的酶提工藝。工藝的因素與水平見表７。

根據(jù)表７的因素水平表，進行Ｌ９（３４）試驗，正交試驗的順序采取隨機抽簽的原則，以體現(xiàn)其隨機性。而且為了提高試驗的準確性，排除單次試驗由于人為失誤造成的誤差，每個試驗號都分別做３次平行試驗，試驗結果取平均值，結果見表８。

以多糖提取率為考察指標，分析果膠酶提取寧夏沙棗多糖的提取工藝，由表８可見，各因素影響主次順序為：Ｂ＞Ｄ＞Ａ＞Ｃ，Ｂ因素即酶的添加量為影響寧夏沙棗多糖提取率的主要因素，Ａ因素的水平３最大，Ｂ因素的水平３最大，Ｃ因素的水平２最大，因此，最佳水平組合為Ａ３Ｂ３Ｃ２，即果膠酶提取沙棗多糖的最佳工藝為ｐＨ值４．３８，添加酶的質量分數(shù)５％，酶提時間３ ｈ。此條件即為正交試驗中的９號試驗，提取率達７２．９３％，為各次試驗最大值，所以不用進行重復性驗證試驗。

３結論

試驗結果表明，酶的添加量是影響寧夏沙棗多糖提取率的主要因素。果膠酶提取寧夏沙棗多糖的最佳工藝為ｐＨ值４．３８，添加酶的質量分數(shù)５％，酶提時間３ ｈ，酶提溫度60℃。最佳條件下沙棗多糖的提取率為７２．９３％。

參考文獻：

［１］ 王雅，趙萍，王玉麗，等． 野生沙棗果實營養(yǎng)成分研究［Ｊ］． 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，２００６，４１（６）：１３０－１３２．

［２］ 辛艷偉． 沙棗的開發(fā)和利用［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學，２００７，３５（２）：３９９－４００．

［３］ 王青寧，呂興連，彭韻碩，等． 沙棗多糖ＥＡＰ－２的提取純化及初步分析［Ｊ］． 食品科學，２００７，２８（１）：４３－４７．

［４］ 廉宜君，李炳奇，劉紅，等． 復合酶輔助超聲波提取沙棗多糖的工藝研究［Ｊ］． 中國中醫(yī)藥信息雜志，２００９，１６（６）：４７－４９．

［５］ 李小平，陳錦屏． 油棗多糖的酶法提取及其對多糖分子量分布的影響［Ｊ］． 食品科學，２００７，２８（８）：１９１－１９２．