譚著明， 申愛榮， 傅紹春， 劉小娟， 唐樹文

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院菌根性食用菌研究開發(fā)中心, 湖南 長沙 410004； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所, 上海 201106;3.桂東縣科技局, 湖南 桂東 423500； 4.桂東縣林業(yè)局,湖南 桂東 423500)

桂東黃菌的科學(xué)名稱辨識兼及慶元黃靛的正名

譚著明1， 申愛榮1， 傅紹春2， 劉小娟3， 唐樹文4

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院菌根性食用菌研究開發(fā)中心, 湖南 長沙 410004； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所, 上海 201106;3.桂東縣科技局, 湖南 桂東 423500； 4.桂東縣林業(yè)局,湖南 桂東 423500)

用形態(tài)分類和ITS序列分析法對湖南桂東黃菌進(jìn)行了鑒定，用基于Bayians理論和Markov chain Monte Carl ( MCMC)算法的MrBayes3.1.2軟件，將桂東黃菌與Genbank中牛肝菌科40個物種85個ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。結(jié)果表明，以歐洲緣蓋牛肝菌(Boletusappendiculatus) ITS序列為外群，湖南桂東黃菌與來自浙江慶元的所謂“緣蓋牛肝菌”的兩個序列以97%的后概率聚為一支，并與云南小美牛肝菌(Boletusspeciosus)之ITS序列以79%的后概率聚為一支，而與歐洲緣蓋牛肝菌ITS序列相比，譜系關(guān)系相距較遠(yuǎn)。認(rèn)為，桂東黃菌的科學(xué)名稱應(yīng)為小美牛肝菌,慶元所產(chǎn)原名為緣蓋牛肝菌的種類也應(yīng)更正為小美牛肝菌。用MrBayes軟件進(jìn)行ITS序列分析的方法，對于在缺乏模式標(biāo)本的情況下，難以準(zhǔn)確識別的大型菌物種類的鑒定不失為一種可資借鑒的有效方法。鑒于小美牛肝菌較高的食用價值和強(qiáng)勁的市場需求，有必要加強(qiáng)栽培、促產(chǎn)等方面的研究。

小美牛肝菌；緣蓋牛肝菌；ITS序列；譜系樹; MrBayes

黃菌是湖南省桂東縣對當(dāng)?shù)厮a(chǎn)的一種商品價值較高的牛肝菌的俗稱。黃菌主要分布于桂東縣增口鄉(xiāng)、寨前鄉(xiāng)、黃洞鄉(xiāng)、新坊鄉(xiāng)、大塘鄉(xiāng)、東洛鄉(xiāng)、普樂鄉(xiāng)、三洞鄉(xiāng)、寒口鄉(xiāng)、城關(guān)鎮(zhèn)及與桂東毗鄰的炎陵縣平樂鄉(xiāng)、江西省遂川縣高坪鎮(zhèn)、上猶縣五指峰鄉(xiāng)個別地段海拔780～900m的馬尾松林中。是一種與馬尾松等樹種共生的菌根性食用菌。其營養(yǎng)豐富、味道鮮美，深受消費(fèi)者喜愛。其干品經(jīng)精細(xì)包裝后作為特產(chǎn)饋贈遠(yuǎn)方親友，是當(dāng)?shù)刂匾牡胤矫a(chǎn)。黃菌的分離培養(yǎng)比較困難，尤其是使其形成子實(shí)體更為不易。目前，市場供應(yīng)全賴野外采集，由于市場緊缺，鮮品平均價格長年維持在70～80元/kg之間，最高達(dá)140元/kg，干品平均價約280～360元/kg。因貨俏價高，過度采摘，自然資源受到一定程度的破壞，產(chǎn)量呈逐年下降之勢。為使這一寶貴資源可持續(xù)地利用，從多領(lǐng)域開展對這一經(jīng)濟(jì)真菌的綜合研究，特別是實(shí)現(xiàn)其人工栽培，或通過其它技術(shù)手段提高現(xiàn)有產(chǎn)菇林分中黃菌的產(chǎn)量乃是必然選擇。

桂東黃菌雖然在當(dāng)?shù)馗邫n農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中聲名顯赫，但從來沒有人對其名稱做過專門考證。類似的情況也曾存在于浙江慶元黃靛牛肝菌[1]。缺乏分類學(xué)意義上的科學(xué)名稱，是其研究者開展學(xué)術(shù)交流，產(chǎn)業(yè)界人士實(shí)施產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化和市場開拓等商務(wù)開發(fā)中存在的一個障礙。

為此，本文采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對桂東黃菌進(jìn)行探究，以圖確定其科學(xué)名稱。

1 材料與方法

1.1試樣采集

用于形態(tài)鑒定和菌種分離的黃菌新鮮子實(shí)體樣品采自桂東寨前鄉(xiāng)境內(nèi)、桂東縣林科所管轄的馬尾松林內(nèi)，地理位置為東經(jīng)113°55.369′,北緯26°02.012′,海拔808m 。采集地為花崗巖發(fā)育的砂壤，坡度32°，坡向?yàn)闁|南，馬尾松平均年齡為24年。密度1350株/hm2。同一處共采集到若干子實(shí)體，取其中無蟲眼和損傷、發(fā)育正常的中等大小的子實(shí)體樣品，分別用于分離培養(yǎng)、形態(tài)描述。

1.2黃菌的分離及鑒定

黃菌分離：采用組織分離法對黃菌新鮮子實(shí)體進(jìn)行分離。培養(yǎng)基A(PDA)：馬鈴薯200g加1000mL純水煮汁過濾，濾液中加葡糖糖20g，加水定容至1000mL；培養(yǎng)基B：NaCl 0.025g，CaCl20.25g，MgSO4·7H2O 0.15g，KH2PO40.5g，(NH4)2HPO40.25g，Ca(OH)20.5g，VB1100μg，葡萄糖8g，酵母膏3g，檸檬酸0.1g，1%檸檬酸亞鐵溶液0.7mL，加水定容至1 000 mL。然后將培養(yǎng)基A和B按照體積比1∶2 混合，固體培養(yǎng)基再加入瓊脂18～20g/L，分裝，121℃滅菌20min備用。

黃菌DNA的提?。翰捎寐然S法(朱衡等 1993)，適當(dāng)改良。操作步驟如下：

(1) 取液體培養(yǎng)7d的黃菌菌液1.2mL于1.5mL離心管中，4000rpm離心5min，棄上清，用1mL TE緩沖液洗滌2次，再加入400μL DNA提取液，混勻。

2) 再加入50 μL 10%SDS、150μL氯化芐，劇烈振蕩，使管內(nèi)混合物呈乳狀。在50℃保溫1～2h，每隔10min振蕩混合一次，直至溶液變粘稠。

(3) 加入50μL 3M NaAc混勻，冰浴15min，6 000rpm 4℃離心15min，取上清。

(4) 加入等體積異丙醇, 室溫沉淀20min，10000rpm 4℃離心15min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，陰干后溶于50μL TE緩沖液。

(5) 提取的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

用ITS1和ITS4作引物，提取的黃菌DNA做模板，擴(kuò)增ITS片斷。正反向引物序列分別為：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC。上述引物由上海生工合成。

反應(yīng)體系如下：反應(yīng)總體積25μL，其中Taq酶1μL，正向引物0.25μLmol，反向引物0.25μl mol，DNA模板50ng。

反應(yīng)程序如下：95℃ 4min預(yù)變性；以下為循環(huán)反應(yīng)過程參數(shù)：94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，此循環(huán)連續(xù)反應(yīng)40次；72℃延伸4min；反應(yīng)產(chǎn)物在4℃下保存。所得PCR產(chǎn)物交由南京金思特公司測序。

用BioEdit 5.0.9[2]、 Clustalx 1.8分別將ITS相關(guān)序列進(jìn)行序列整理、比對。用MrBayes 3.1.2軟件分析，并繪出譜系圖(系統(tǒng)發(fā)育樹)。

2 結(jié)果與分析

2.1黃菌的形態(tài)特征

菌蓋8～15cm，半球形至凸，后變寬凸，邊沿反卷至平坦，偶有麻點(diǎn)和大而不規(guī)則形凹陷；表面干，無光澤，邊緣向內(nèi)彎曲，全體亮紅至玫瑰粉紅，或最終變暗而成葡萄酒色或更亮，受傷變藍(lán)。肉厚，10～15mm，實(shí)，切開處組織蒼白黃色，很快變藍(lán)；新鮮時有稍濃郁之菌香味；遇KOH顯橙色，遇FeSO4顯灰色。菌管9～15mm長，并生或下陷，菌柄上有下延線或網(wǎng)狀組織，稍老時，菌柄常由亮黃色變?yōu)槊埸S色。菌柄長5～13cm，頂部1.5～4cm厚,基部棍棒狀至窄截形,實(shí), 肉黃,至頂部蒼白,上部色淡黃，受傷很快變藍(lán),基部常為鉻黃色。孢子印橄欖褐色,孢子11～15×3～4μm,光滑, 正面觀窄橢圓形至擬紡綞形，末端稍尖。此形態(tài)特征與Smith 及Thiers 對小美牛肝菌(Boletusspeciosus)標(biāo)本的描述基本一致[3]。

2.2黃菌ITS序列分析及與牛肝菌科其它種類的關(guān)系

經(jīng)對測序結(jié)果與ITS首尾起止位置進(jìn)行精確比對，去掉冗長多余堿基，得到黃菌ITS序列如下：

GAGGGGGGGGAGATGGAGGAGTGAAGACTGTCGCTGGCCCCATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACGTCTTCCTTTTCGTCGACCCCCTTTCTCACACACAACACACACCTGTGCACCTGTTGTAGGTCCTCGGAAGAGGATCTATGTTTTTCACATCACACACCATCATATGTCTATAGAATGTATTGAAGACCGTCCGGGATG(ITS1)GATGGTCAATAATATTAAATCATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATTTTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTC(58SrRNA)CGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTTGAATTTCTCAAACCCCATGTCTTTTTTAGAGCATGAGCTTTGGAGTTGGGGGCTGCTGGCGGCGAAAAGCCGTCGGCTCTCCTGAAATGCATTAGCAAAGGATGGGGCAAGTCTTTGACGTGCATGGCCTTCGACGTGATAATGATCGTCGTGGCTAGGAGCGTCGGACATGCATGAATCTGTCTGTGCTGCTTCTAATCCCCTA(ITS2)GGCTAGCCTCGGCTTGGTCACTTTTAACTACTAGTTGGTCGTGAGGCTGACGAACGTTGAGTTGGGCTGAGCAAGGCTTTTTGTCTCTATTCAAACCTTGACCTCAAATCAGGTAGAACTACCCGCTGAACTTAACAATATCATAACCGGAAGAAAAA(28SrRNA)

將上述來源于桂東黃菌的ITS序列用GD0001表示(下同)。該序列提交Genbank，得到序列號為HQ651150

從Genbank中搜索出已登錄的牛肝菌科多個物種的ITS序列，以Boletusappendiculatus作為外群，構(gòu)建MrBayes譜系圖(圖1)。構(gòu)建方法見圖1說明。用Genbank中嵌套的Blast搜索比對軟件將GD0001與多種牛肝菌科物種的ITS序列比對知，桂東黃菌的ITS序列(GD0001)與小美牛肝菌(ITS序列號DQ407253，來自云南)和緣蓋牛肝菌(ITS序列號GU233428，來自浙江)最為接近，同源性達(dá)98%～99% 。

根據(jù)圖1中后驗(yàn)概率大小與種類的相關(guān)性可以看出，凡分枝后驗(yàn)概率在80%以上的，該分枝基本上系同一物種不同個體ITS序列聚集而成。如AY185180，AY185181，AY185182，AY185183，AY185185以96%的后驗(yàn)概率聚為一支，且均為B.dryophillus; HM347664, HM347667,HM347647以99%的后驗(yàn)概率聚為一支,均為B.rhodopurpurues; 與桂東黃菌(GD0001)聚為一支的3個序列DQ407253、GU233427和GU233428，它們雖被序列提交者定名為不同的種，即DQ407253為來源于中國云南的小美牛肝菌(B.speciosus)之ITS序列，GU233427和GU233428為來源于中國浙江省慶元縣緣蓋牛肝菌(B.appendiculatus)的ITS序列(李海波等，2007)。但它們以79%的后驗(yàn)概率聚為一支，說明其相似性很高，當(dāng)歸入同一物種。這一看似矛盾的結(jié)果，可能是提交上述序列的個別作者因形態(tài)分類不準(zhǔn)確導(dǎo)致的問題。支持這一看法的另一個依據(jù)是，圖1中HM347641和HM347642兩個ITS序列，均由葡萄牙 Tras-os-Montes and Alto Douro大學(xué)的G.M.Marques等于2010年5月18日提交,樣品為采自歐洲的B.appendiculatus，卻獨(dú)立成支，與GU233427和GU233428有較大差異。從真菌分類命名的可靠性看，個人認(rèn)為歐洲是現(xiàn)代真菌分類學(xué)的發(fā)源地，有良好的分類學(xué)基礎(chǔ)，而我國真菌分類學(xué)基礎(chǔ)較薄弱，可靠的標(biāo)本積累少。即使國內(nèi)少有的幾個以收集、研究真菌標(biāo)本著稱的標(biāo)本館也多存在誤定[4-5],國內(nèi)對小美牛肝菌等種名的誤定也就難免。因此，本文采信出自葡萄牙的緣蓋牛肝菌(B.appendiculatus)為正確名稱。因出自浙江的所謂“緣蓋牛肝菌”ITS序列與來自葡萄牙的HM347641和HM347642兩序列并未聚成一支，從而可以認(rèn)定其非正宗緣蓋牛肝菌。考慮到前文描述的桂東黃菌形態(tài)特征與B.speciosus的原始描述一致，且有與采自云南的小美牛肝菌序列同源性達(dá)98%的事實(shí)佐證，本文認(rèn)為桂東黃菌即是B.speciosus,而浙江所產(chǎn)緣蓋牛肝菌也應(yīng)更正為B.speciosus，即小美牛肝菌。事實(shí)上，從形態(tài)看，小美牛肝菌與緣蓋牛肝菌相比，菌柄較細(xì)長，并有傷后更易于變藍(lán)的傾向[6]。

此外，用Clustalx1.8軟件對上述各個ITS序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果如下：GU233428與GD0001相比,695個對應(yīng)堿基中,只有7個堿基有差異,占1.007%。其中ITS1區(qū)有3個不同堿基，ITS2僅1個堿基不同，28S區(qū)僅尾部3個堿基不同?？紤]到28S區(qū)尾部可能是ITS序列測序時的隨機(jī)誤差，如果將之剔除，則二者的相似度幾近100%，說明二者系同一物種。但GD0001與HM34764相比，在661個對應(yīng)堿基中，共有44個不同位點(diǎn)的堿基有差異，占6.657%。其中ITS1區(qū)對應(yīng)堿基不同的有22個，5.8S區(qū)不同的有6個,ITS2區(qū)有9個,28S區(qū)有7個。說明二者系不同的兩個物種，進(jìn)一步印證了前面的推論。

綜合上述形態(tài)特征和ITS序列比對及MrBayes軟件分析結(jié)果，可以確定桂東黃菌為小美牛肝菌(B.speciosus)，屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，牛肝菌科(Boletaceae)，牛肝菌屬(Boletus)。

3 結(jié)論與討論

3.1關(guān)于種名的認(rèn)定

通過桂東黃菌形態(tài)特征與B.speciosus模式標(biāo)本的描述特征相比較，并將其ITS序列與Genbank中的相關(guān)序列進(jìn)行比對分析，可將桂東黃菌的科學(xué)名稱確定為小美牛肝菌(B.speciosus)。本文的研究證實(shí)產(chǎn)自浙江的緣蓋牛肝菌系名稱誤定，應(yīng)更名為小美牛肝菌。Genbank中的序列號GU233427和GU233428,雖沒有說明樣品的采集地, 但李海波等(2007)論文中的ITS序列樣品已注明來自于浙江慶元縣,且除ITS序列前后兩尾少數(shù)堿基不一外,中間部分與GU233427完全相同，據(jù)此推測GU233427的來源樣品亦來自浙江慶元。而且李海波等[7]也認(rèn)定，所測ITS序列與云南的B.speciosus(DQ407253)用Blast軟件進(jìn)行同源性比對，相似度達(dá)99%，并認(rèn)為二者“極為相似”，與本文比對結(jié)果一致。該作者實(shí)際上對浙江慶元“黃靛牛肝菌”被定名為緣蓋牛肝菌是存疑的，認(rèn)為二者種屬關(guān)系“尚待進(jìn)一步研究”。之所以不能定論，是因?yàn)闃?biāo)本曾由國內(nèi)牛肝菌分類專家做過形態(tài)鑒定，加之當(dāng)時Genbank數(shù)據(jù)庫中尚無正宗緣蓋牛肝菌ITS序列可供佐證。

圖1 牛肝菌科部分種類ITS序列譜系樹圖Fig. 1 Phylogenic tree of some species belong to Boletaceae with ITS sequences

本文確認(rèn)產(chǎn)自湖南桂東的黃菌、浙江慶元的黃靛牛肝菌、及云南的小美牛肝菌，盡管地理直線距離彼此相差約500km(慶元至桂東)～1100km(桂東至昆明)，但均系同一物種。由此也可推斷，小美牛肝菌不僅分布于美國，也分布于中國云南、湖南、浙江等區(qū)域。

3.2關(guān)于分子生物學(xué)方法對菌物種類鑒別的意義

牛肝菌科的種類繁多，共有13個屬[12]，僅牛肝菌屬就超過100種。用傳統(tǒng)方法對其進(jìn)行系統(tǒng)分類是令專家也難以面對的巨大挑戰(zhàn)。因此，借助分子生物學(xué)工具，利用具有分類學(xué)價值的DNA特征序列進(jìn)行輔助鑒別的方法受到分類學(xué)和相關(guān)學(xué)科研究者重視[13-16]。事實(shí)上，多基因片斷分析在大型菌物系統(tǒng)分類中已成為不可或缺的手段[17-19]。牛肝菌是一個十分復(fù)雜的類群，要確切弄清其分類關(guān)系，清楚地區(qū)分不同種類，需要傳統(tǒng)的細(xì)微表型特征描述與現(xiàn)代分子生物學(xué)手段的完美結(jié)合。

3.3加強(qiáng)小美牛肝菌開發(fā)的必要性

小美牛肝菌是一種美味食用菌，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)意義。無論是浙江慶元，還是湖南桂東，都自然形成了當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)美食，并成為遠(yuǎn)近有名的天然山珍，對地方經(jīng)濟(jì)和特色文化有積極影響。就桂東縣而言，小美牛肝菌的采收、貿(mào)易已是產(chǎn)地部分農(nóng)民家庭收入的重要補(bǔ)充。據(jù)我們調(diào)查，桂東寨前鄉(xiāng)、新坊鄉(xiāng)、黃洞鄉(xiāng)有的農(nóng)民家庭每年靠居所附近采收、銷售小美牛肝菌，年收入可達(dá)12000元，有的近20000元。這一獲利方式，不損害環(huán)境，是一種可持續(xù)的自然生產(chǎn)模式。不僅如此，在這些地區(qū)開展小美牛肝菌栽培和增產(chǎn)技術(shù)的研究，成功后加以推廣，將具有非常重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。這一經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式無論對于發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家均具有一定的重要性[19-20]，而對于后者的意義更為顯著[21]?？上驳氖牵覈鞯鼐验_始重視該菌種的研究開發(fā)，浙江省曾以重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目和自然科學(xué)基金項(xiàng)目支持當(dāng)?shù)乜蒲袡C(jī)構(gòu)開展以小美牛肝菌分離鑒定、疏水蛋白功能基因克隆及表達(dá)方面的研究工作，麗水市也列項(xiàng)支持仿生栽培研究。湖南省科技廳通過農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目支持小美牛肝菌菌根苗繁育與栽培技術(shù)研究和推廣，相關(guān)基礎(chǔ)工作還列入了國家“863”特殊食用菌產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)的研究內(nèi)容。但是，作為一種菌根菌，小美牛肝菌的栽培難度超過迄今已獲栽培成功的塊菌、紅汁乳菇等[15，22]其它菌根性食用菌，這一特點(diǎn)決定了小美牛肝菌的研究需要多學(xué)科、多領(lǐng)域的協(xié)同合作和持續(xù)地項(xiàng)目支持。

致謝： 中國科學(xué)院昆明植物研究所楊祝良研究員曾閱讀此文并提出了寶貴建議，在此謹(jǐn)致謝忱！研究工作中得到桂東縣鐘建鋼副縣長、林業(yè)局郭遠(yuǎn)飛局長等大力支持，在此深表感謝。

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RecognitionofthescientificnameofGuidongHuangjunandcorrectionofQingyuanHuangdian

TAN Zhuming1, SHEN Airong1, FU Shaochun2, LIU Xiaojuan3, TANG Shuwen4

(1.Ectomycorrhizal Mushroom Center, Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004， China;2.Mushroom Insitute, Shanghai Academy of Agriculture, Shanghai 201106, China;3.Science and Technology Bureau of Guidong County, Guidong 423500, China;4.Forestry Bureau of Guidong County, Guidong 423500, China)

The Huangjun at Guidong County,Hunan Province was identified with both morphological method and ITS sequence analysis method, and ITS sequence of DNA from mycelia of Huangjun produced at Guidong was compared with that of so calledBoletusappendiculatus(Huangdian) produced at Qingyuan County, Zhejiang Province, and with that ofB.speciosusproduced in Yunnan Province with MrBayes 3.1.2, which was clustered with species from Qingyuan to a clade with posterior rate of 97% in the phylogenic consensus tree and were together clustered withB.speciosusfrom Yunnan to a clade with posterior rate of 79%. However, all of above ITS sequences never clustered withB.appendiculatusfrom European to a clade. The result showed that the scientific name of Huangjun at Guidong County should beB.speciosus, and so-calledB.apppendiculatus(Huangdian) in Zhejiang would be also changed toB.speciosus. It is an effective way to be used for reference to identify those fungi which were difficult to distinguish exactly from each other when lacking of model specimen. In the light of its high edible value and great demanding market, theB.speciosuswould be paid more attention and need more continuing financial support so that further deep and detail researches, such as cultivation, yield improving, and so on, could be done.

Boletusspeciosus;Boletusappendiculatus; ITS sequence; Phylogenic tree; MrBayes

2011 — 02 — 26

2011 — 03 — 09

國家科技部“863”項(xiàng)目(2007AA021506)及湖南省農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目(2008NK4027)。

S 567.3+9

A

1003 — 5710(2011)02 — 0009 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2011. 02. 003

(責(zé)任編輯：張 珉)