陳千益 歐敬民 劉穎斌 穆嘉盛 莊鵬遠(yuǎn) 何曉華

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)病機(jī)制中已發(fā)現(xiàn)許多相關(guān)基因高或低表達(dá)、變異或缺失等影響著腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲或轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要的作用。通過檢測(cè)胃癌組織中的相關(guān)基因，對(duì)臨床治療及評(píng)估預(yù)后有一定的價(jià)值。近年來，酪氨酸蛋白激酶EphA7在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的作用受到越來越多關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)EphA7在許多惡性腫瘤中表達(dá)異常，且與腫瘤血管的形成、腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移過程有密切關(guān)系［1～6］。本研究通過檢測(cè)酪氨酸蛋白激酶 EphA7蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，旨在探討EphA7蛋白表達(dá)水平及與其臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院2003年1月至2008年12月、手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)為胃癌的83例標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，術(shù)前均未行放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療。其中男性56例，女性27例;年齡43～82歲，平均64歲。83例胃癌中，近端胃癌(U)17例(20.5%)、中段胃癌(M)13例(15.7%)和遠(yuǎn)端胃癌(L)53例(63.8%)。經(jīng)病理檢查證實(shí)高分化腺癌11例(13.3%)，中分化腺癌35例(42.2%)，低分化腺癌29例(34.9%)(其中印戎細(xì)胞癌16例、黏液腺癌13例)，未分化腺癌8例(9.6%);Borrmann大體類型:潰瘍型11例(13.3%)，乳頭狀型17例(20.5%)，結(jié)節(jié)型 23 例(27.7%)，浸潤(rùn)型 32 例(38.5%);浸潤(rùn)深度:T1 4 例(4.8%)(黏膜下層)，T2 21例(25.3%)(肌層6例、漿膜下層15例)，T3 39例(47.0%)(漿膜層)，T4 19 例(22.9%)(累及鄰近臟器);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:陰性23例(27.7%)，陽性60例(72.3%);TNM 分期:Ⅰ期 6 例(7.2%)，Ⅱ期 14 例(16.9%)，Ⅲ期 35 例(42.2%)，Ⅳ期 28 例(33.7%)。83例患者中45例行血清CA19-9、癌胚抗原(CEA)檢查，其中血清CA19-9陽性率為84.4%(38/45)(分界值34 000 U/L)，血清 CEA陽性率為22.2%(10/45)(分界值19 μg/L)。對(duì)照組30例癌旁組織，均經(jīng)病理檢查證實(shí)為手術(shù)切緣陰性標(biāo)本。

1.2 試劑與方法

EphA7蛋白鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司，S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。應(yīng)用免疫組化法，檢測(cè)胃癌組織中EphA7表達(dá)，將蠟塊制成4 μm厚的切片。選取1張行常規(guī)HE染色，確定組織學(xué)分化程度，檢測(cè)胃癌組織中EphA7表達(dá)的步驟如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水洗;0.01 mol/L pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓1.5 min，分別用3%H2O2和非免疫血清阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，并封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn);滴加一抗(EphA7 1∶200稀釋)，4℃過夜;生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30 min;SP復(fù)合物37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化2～3 s，脫水、透明、中性樹膠封片。以已知EphA7陽性組織切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 雙人盲法觀片 在不知道臨床病理資料的情況下，對(duì)免疫組化切片進(jìn)行評(píng)估。EphA7抗原定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的顆?；虬咂┡哉＝M織中也可見EphA7陽性表達(dá)，但顏色較淺，呈淺黃色。

1.3.2 光鏡下計(jì)分標(biāo)準(zhǔn) 按切片中細(xì)胞顯色有無及深淺計(jì)分(A):0分，細(xì)胞無顯色;1分，胞質(zhì)顯色為淺黃色;2分，胞質(zhì)顯色為棕黃色;3分，胞質(zhì)顯色為棕褐色。按切片中顯色細(xì)胞的比例計(jì)分(B):1分，顯色癌細(xì)胞占癌細(xì)胞總數(shù)＜1/3;2分，癌細(xì)胞顯色比例在1/3～2/3;3分，癌細(xì)胞顯色比例＞2/3。每例積分=A×B，按積分高低分為:0分為陰性(－);1～2分為弱陽性(+);3～6分為陽性(++);＞6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 隨訪及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

電話隨訪或信訪。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，根據(jù)數(shù)據(jù)類型不同分別進(jìn)行t檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)分析、χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法;生存率的計(jì)算采用Kaplan-Meier法，并作Long-Rank檢驗(yàn)及 Cox多因素生存分析。

2 結(jié)果

2.1 EphA7蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況

EphA7蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀或斑片狀，染色均一;癌旁組織中也可見EphA7蛋白陽性表達(dá)，但顏色普遍較淺，呈淺黃色。83例腫瘤組織中，EphA7蛋白表達(dá)陽性68例(81.9%)。對(duì)照組30例中EphA7陽性表達(dá)7例(23.3%)。EphA7蛋白陽性表達(dá)率胃癌組織高于癌旁正常組織(P＜0.05)(表1)。

表1 EphA7蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況(例，%)

2.2 EphA7蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

EphA7蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(表2)。

表2 EphA7蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.3 術(shù)前血漿腫瘤標(biāo)志物濃度與EphA7蛋白表達(dá)水平的關(guān)系

83例胃癌患者中45例行血清CA19-9、CEA檢測(cè)。EphA7蛋白陽性表達(dá)組術(shù)前血清CA19-9濃度［(315 500 ±45 700)U/L，n=36］高于陰性表達(dá)組［(94 300 ± 27 200)U/L，n=9］(t=2.259，P=0.038)。EphA7蛋白陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組血清CEA 濃度分別為(34.3 ±6.5)μg/L 和(23.5 ±5.9)μg/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.433，P=0.155)。E-phA7蛋白表達(dá)水平與血清CA19-9、CEA呈正相關(guān)性(表3)。

表3 EphA7蛋白表達(dá)與血清CA19-9、癌胚抗原(CEA)的關(guān)系

2.4 EphA7蛋白表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系

2.4.1 EphA7蛋白表達(dá)陽性組及陰性組的生存情況83例患者中EphA7蛋白表達(dá)陽性者68例，陰性者15例。Kaplan-Meier生存分析顯示，83例患者1、2、3、5 年生存率分別為 79.2%、66.7%、57.5% 和 20.3%，平均生存期為37.8個(gè)月。其中EphA7蛋白表達(dá)陰性組1、3、5 年生存率分別為 91.4%、75.6% 和 39.5%，平均生存期為48.3個(gè)月;EphA7蛋白表達(dá)陽性組1、3、5 年生存率分別為 67.5%、35.2% 和 12.3%，平均生存期為22.7個(gè)月。EphA7蛋白表達(dá)陽性組與陰性組生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.568，P=0.001)。

2.4.2 EphA7蛋白表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響 單因素分析顯示，患者年齡、浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和EphA7蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后有關(guān)，而性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤大體分型與患者預(yù)后無關(guān)。對(duì)單因素篩選出的顯著性變量，納入Cox模型進(jìn)行多因素生分析，結(jié)果顯示EphA7蛋白表達(dá)水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期是胃癌獨(dú)立的預(yù)后因素。

3 討論

3.1 EphA7蛋白在胃癌中表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性

EphA7是酪氨酸蛋白激酶受體家族(receptor tyrosine kinase，RTK)中的一員，定位于染色體6q16.1靠近斷裂點(diǎn)的位置，在人體內(nèi)分布廣泛，參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、胚胎發(fā)育及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)換等過程中具有相當(dāng)重要的生理功能［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)EphA7在許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可能是反映惡性腫瘤進(jìn)展、生物學(xué)行為及預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。Surawska等［8］研究發(fā)現(xiàn)，EphA7在肺癌組織中的表達(dá)水平較正常肺組織中上升了4.6倍，而Hafner等［9］研究顯示結(jié)腸癌組織中EphA7表達(dá)水平較正常結(jié)腸癌組織中下降了5.8倍。本研究結(jié)果顯示，E-phA7蛋白陽性表達(dá)率為81.9%，相應(yīng)的癌旁組織陽性表達(dá)率為23.3%，陽性染色定位于胃癌細(xì)胞質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞中;與癌旁組織比較，EphA7蛋白的表達(dá)陽性率在胃癌組織中明顯上調(diào)。有研究顯示，胃癌腫瘤Borrmann大體分型、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、切緣癌殘留、治療方式等是影響患者生存率的重要因素［3，10］。本研究顯示，EphA7 蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)性，與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)性。

3.2 EphA7蛋白表達(dá)與胃癌侵襲性生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

EphA7蛋白在癌組織中的表達(dá)水平與惡性腫瘤的侵襲性及預(yù)后有關(guān)［1～6，8～10］。腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要外部因素，它不僅為腫瘤提供充足的營(yíng)養(yǎng)，而且為轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞提供了通道。大量的生物化學(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)提示了Eph/Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)通道在血管發(fā)生、發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用［11］。本研究中，EphA7蛋白高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，同時(shí)顯示與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。由此可見，EphA7蛋白主要影響胃癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，通過檢測(cè)胃癌細(xì)胞EphA7蛋白表達(dá)水平，可初步判斷胃癌生物學(xué)行為的惡性程度。

3.3 EphA7蛋白表達(dá)水平與術(shù)前血漿腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

CA19-9是診斷和檢測(cè)消化道惡性腫瘤的有效腫瘤標(biāo)志物之一，而且CA19-9水平進(jìn)行性升高在臨床癥狀出現(xiàn)之前，可作為術(shù)后判斷腫瘤復(fù)發(fā)的指標(biāo)［12］。目前，尚未見EphA7蛋白表達(dá)與血清CA19-9關(guān)系的詳細(xì)報(bào)道。本研究顯示，EphA7蛋白陽性表達(dá)組術(shù)前血清CA19-9濃度高于陰性表達(dá)組，血清CEA濃度也高于陰性表達(dá)組，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;EphA7蛋白表達(dá)與血清CA19-9、CEA濃度呈正相關(guān)性。

3.4 EphA7蛋白表達(dá)水平與胃癌預(yù)后的相關(guān)性

EphA7在不同腫瘤中發(fā)揮的作用有可能不同，而這種可能與EphA7能和不同的Ephrin配體結(jié)合后產(chǎn)生的雙向信號(hào)調(diào)節(jié)有關(guān)，提示EphA7可能主要作為1種致癌蛋白參與了腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及參與血管形成作用［1，8～11］。而腫瘤組織中高水平的EphA7蛋白必然導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制、細(xì)胞周期的改變，引起腫瘤細(xì)胞增殖過旺，加之E-phA7蛋白高表達(dá)引起腫瘤組織新生血管增多，血液供應(yīng)豐富，更加引起腫瘤細(xì)胞增殖過旺，這樣就導(dǎo)致腫瘤形成［3，6］。已形成的腫瘤組織因EphA7蛋白進(jìn)一步表達(dá)，使該腫瘤細(xì)胞不易凋亡，有惡性繁殖的條件及傾向，故其臨床預(yù)后較差［13］。研究表明，結(jié)腸癌中 E-phA7低表達(dá)與患者性別、癌細(xì)胞分化程度、腫瘤發(fā)生部位等有關(guān)，而與患者年齡無關(guān)［4，9］。而胃癌中 E-phA7高表達(dá)與患者年齡、腫瘤分期有關(guān)，術(shù)后5年生存率有顯著差異，提示EphA7蛋白表達(dá)可以影響腫瘤生物學(xué)行為，可使其更易發(fā)生局部與血行復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等惡性行為，是預(yù)后不良的指征［3，10，11，13，14］。本組資料顯示，EphA7蛋白表達(dá)是胃癌患者預(yù)后差的標(biāo)志，EphA7蛋白表達(dá)陽性組 1、3、5年生存率分別為67.5%、35.2%和12.3%，顯著低于陰性組 1、3、5 年生存率;多因素分析顯示，EphA7蛋白表達(dá)水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期為胃癌根治術(shù)后獨(dú)立的預(yù)后因素，EphA7蛋白表達(dá)陽性提示預(yù)后不良。

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