李建旺 彭大為 黃春珍 元建華

體內(nèi)回輸免疫活性細(xì)胞的過繼免疫療法是繼手術(shù)、放療、化療之外的另一種重要的腫瘤治療方法。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced kiuer，CIK)兼具T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和NK非MHC限制性殺瘤細(xì)胞功能，且體內(nèi)外增殖能力強(qiáng)［1］，是一類殺瘤活性和殺瘤譜更強(qiáng)的新型抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。體內(nèi)回輸樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，可有效激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答［2］，有效抵制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制［3］。DC與CIK是腫瘤免疫治療的2個重要部分，前者識別病原，激活獲得性免疫系統(tǒng)，后者通過發(fā)揮自身細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，兩者聯(lián)合確保了1個高效和諧的免疫反應(yīng)的完成。本研究小組進(jìn)行了自體DC-CIK細(xì)胞采用靜脈回輸聯(lián)合索拉非尼治療44例晚期原發(fā)性肝癌患者，并將其近期療效報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

選擇?？谑腥嗣襻t(yī)院腫瘤科2008年1月～2010年3月經(jīng)檢查確診為晚期原發(fā)性肝癌的患者44例，經(jīng)影像學(xué)確診但無法行手術(shù)及放療治療。在DC-CIK治療前進(jìn)行索拉非尼分子靶向治療，索拉非尼400 mg/次，2次/天，連續(xù)服用4周。12周為1個療程，如無明顯不良反應(yīng)則重復(fù)療程。治療期間每周查血常規(guī)1次，每月查肝功能1次，白細(xì)胞計數(shù)＜3×109/L或肝功能異常時停藥8周后進(jìn)行評價，對藥物反應(yīng)性好及可耐受治療者停藥2～4周重復(fù)下一周期治療。患者均簽署知情同意書。索拉非尼分子靶向治療與DCCIK治療間隔時間在2周以上，患者肝病灶腫瘤2 cm×3 cm至14 cm×10.8 cm大小之間，含肝硬化、門靜脈及下腔靜脈癌栓、腹腔積液、黃疸、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者。

1.2 DC和CIK細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增

治療細(xì)胞數(shù)量及重量模擬入院后行MRI檢查，根據(jù)MRI確定腫瘤大小，計算出腫瘤體積。采血前24 h應(yīng)用GM-CSF行外周血干細(xì)胞動員。

1.2.1 細(xì)胞分離 經(jīng)CS-3000血細(xì)胞分離機(jī)分別采集患者的外周血5 L中的新鮮抗凝外周血單核細(xì)胞，再用聚蔗糖400(Ficoll 400)(中國科學(xué)院生物物理研究所)分離后經(jīng)Hank’s液洗3次，收集純度在90%以上的外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMNC)。

1.2.2 CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增PBMNC 調(diào)整濃度為 1×106/L，第1天加入 rh-干擾素1 000 U/mL，第2天開始加入抗 CD3單抗 50 μg/mL，IL-1a 100 U/mL，IL-2 1000 U/mL，連續(xù)培養(yǎng)3天，更換含有上述因子的培養(yǎng)液1次，連續(xù)培養(yǎng)10～20天。每周2次測定白細(xì)胞增殖率和CD3、CD56陽性細(xì)胞率，當(dāng)細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增達(dá)到設(shè)計目標(biāo)，陽性目標(biāo)細(xì)胞達(dá)到85%時，進(jìn)行細(xì)胞治療。

1.2.3 DC細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增 將CS-3 000分離得到的PBMNC(調(diào)整濃度為1×106/L)培養(yǎng)2 h，棄上清，獲得貼壁單核細(xì)胞，向每孔加入完全培養(yǎng)基，GM-CFS 100 ng/mL，IL-4 500 U/mL，培養(yǎng) 5 天后加入HSP復(fù)合物1 ng/mL，在培養(yǎng)7天后就可收集懸浮的DC。每份全血可收獲1.2×108～2.0×108DC，無菌檢驗合格后，可以按方案給患者治療。

1.2.4 DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng) 將致敏過的DC與未經(jīng)致敏的DC計數(shù)后，以DC:CIK=1∶3的比例和CIK細(xì)胞混合，用CIK培養(yǎng)液培養(yǎng)產(chǎn)生DC-CIK細(xì)胞。DC-CIK共培養(yǎng)物和CIK細(xì)胞的增殖性能比較于共培養(yǎng)當(dāng)日起用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)，動態(tài)觀察 DC共培養(yǎng)物的表型變化，分別于細(xì)胞培養(yǎng)的第9天檢測 DC表面標(biāo)記 CD40，CD80，HLA-DR和第9，14天檢測 CIK和 DC-CIK 共培養(yǎng)物表面標(biāo)記 CD3，CD56，CD4，CD8。

1.3 治療方案

患者口服索拉非尼治療完成1個月，2周后回輸CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞，2～3次/周，一次回輸CIK 1×1010～2×1012，DC 細(xì)胞 1×109～1×1010。

1.4 觀測指標(biāo)及療效評估

觀測指標(biāo)包括瘤體變化、腫瘤標(biāo)志物、免疫指標(biāo)、生存期、癥狀、生存質(zhì)量及不良反應(yīng)等。療效評估參照Recist對實體瘤療效判定標(biāo)準(zhǔn):以患者治療前及治療后1個月CT及B超檢查結(jié)果進(jìn)行對照比較，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、輕度緩解(MR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD)，緩解 =CR+PR+MR［4］;臨床癥狀評價根據(jù)其積分值，積分值下降≥2/3為顯著改善，積分下降1/3為部分改善，積分下降＜1/3為無改善［4］;生存質(zhì)量評價根據(jù)患者Karnofsky評分和體質(zhì)量;不良反應(yīng)以患者主訴為依據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CIK和DC-CIK培養(yǎng)結(jié)果

CIK和DC-CIK共培養(yǎng)的增殖活性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞在培養(yǎng)中有較高的增殖，而DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞具有更高的增殖活性。細(xì)胞在第3天后開始增殖，第5～6天快速增長，培養(yǎng)20 d時，CIK細(xì)胞和 DCCIK共培養(yǎng)的細(xì)胞增殖倍數(shù)分別為120和1000。CIK培養(yǎng)的第21天，效靶比為5∶1時，CIK對Bel-7404細(xì)胞的細(xì)胞毒活性為46.7%。

2.2 DC-CIK 細(xì)胞表型

第 9天 CD3+，CD56+細(xì)胞占4.89% ～6.92%，CD3+，CD8+細(xì)胞占48.2% ～51.3%;第14天 CD3+，CD56+細(xì)胞占 14.78% ～16.82.%，CD3+，CD8+細(xì)胞占76.2% ～78.3%;第21 天 CD3+，D56+細(xì)胞占46.89% ～56.92%，CD3+，CD8+細(xì)胞占 68.4%～88.5%，見表 1。

表1 CIK細(xì)胞免疫治療前后患者外周血免疫學(xué)指標(biāo)變化(s，%)

表1 CIK細(xì)胞免疫治療前后患者外周血免疫學(xué)指標(biāo)變化(s，%)

免疫指標(biāo) 治療前 治療后 P值CD3+ 42.72 ±7.34 71.38 ±9.25 ＜0.01 CD4+ 24.33 ±2.98 35.77 ±4.38 ＜0.01 CD8+ 21.36 ±3.47 28.29 ±2.76 ＜0.05 CD4+/CD8+ 1.37 ±0.26 1.58 ±0.12 ＜0.05 CD16 5.45 ±0.38 9.24 ±0.66 ＜0.01 CD56 23.84 ±5.17 26.41 ±4.05 ＜0.05

2.3 療效觀察

患者經(jīng)1個療程DC-CIK靜脈回輸治療后自覺癥狀改善，食欲增強(qiáng)，睡眠改善，疼痛減輕，體重?zé)o明顯下降，體力較前好轉(zhuǎn)，見表2。索拉非尼治療的不良反應(yīng)減輕，腹腔積液吸收，黃疸完全消退，轉(zhuǎn)氨酶治療后恢復(fù)正常，腫瘤生長緩慢，右肝病灶減少15%。索拉非尼聯(lián)合1個療程DC-CIK治療后CR 0例，PR 15例，MR 22例，SD 5例，PD 2例，總緩解率為84.1%。

表2 44例患者CIK免疫治療前后患者臨床癥狀改善分析

2.4 不良反應(yīng)

不良反應(yīng)一般在回輸1～2 h出現(xiàn)。存在不同程度的發(fā)熱，其中低熱8例，高熱2例，持續(xù)時間在2～8 h，除1次采用解熱鎮(zhèn)痛藥外，其余均自行消退?；剌敽笮醒Ｒ?guī)、肝腎功檢查，均未發(fā)現(xiàn)明顯改變。

3 討論

原發(fā)性肝癌具有起病隱匿、病程短、進(jìn)展快、程度高、生存期短等特點，發(fā)現(xiàn)時多屬晚期，故臨床治療難度大，患者生活質(zhì)量差，病死率高，嚴(yán)重危害著人類的生命和健康。治療肝癌的還有化療、放療方法以及其他多種治療方法，如化學(xué)栓塞、皮下注射乙醇或乙酸和肝移植等，但是，這些治療方法預(yù)后效果不甚理想。

索拉非尼(sorafenib)，商品名:多吉美，是1種多靶點的抗腫瘤藥物，屬多激酶抑制藥。索拉非尼具有雙重抗腫瘤效應(yīng)，一方面，它可以通過抑制 RAF/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路，直接抑制腫瘤生長;另一方面，它又可通過抑制VEGFR和PDGFR而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

一個大樣本的安慰藥對照的索拉非尼治療肝癌的方案:索拉非尼組 PR占2.3%，安慰藥組為0.7%，SD分別為 71.0% 和 67.0%，PD 分別為18.0% 和24.0%;4個月無惡化率分別為 62.0%和42.0%，中位惡化時間分別為24.0 和 12.3 周(P ＜0.01)［5］。

我國原發(fā)性肝癌的主要病因是乙型肝炎病毒慢性感患者均存在不同程度的免疫功能缺陷，這可能與機(jī)體外周血中DC數(shù)量減少，功能減低有關(guān)。有實驗證實，肝癌患者CIK的增殖速度較正常人慢，且增殖倍數(shù)也有所降低［6］，體內(nèi)注射DC細(xì)胞，DC與T細(xì)胞結(jié)合后，大量分泌IL-12，誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答，有利于腫瘤清除。DC尚能分泌多種趨化因子，作用于初始T細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞活性。DC與CIK共培養(yǎng)后產(chǎn)生的細(xì)胞群體比同原CIK細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖活性。CIK與DC相結(jié)合，不僅提高了CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，也能顯著提高DC的功能［7］。DC與CIK混合培養(yǎng)時，兩者能相互調(diào)節(jié)而增加細(xì)胞因子釋放和增強(qiáng)細(xì)胞毒性，顯著提高CIK細(xì)胞的增殖能力和殺傷活性，臨床治療效果優(yōu)于CIK等其他效應(yīng)細(xì)胞。

由于過繼免疫治療效果與效應(yīng)細(xì)胞的治療次數(shù)和投給數(shù)量有關(guān)，適當(dāng)增加治療次數(shù)和數(shù)量，可進(jìn)一步提高療效。本研究小組平均治療3周，細(xì)胞總數(shù)達(dá)到了個性化設(shè)計的數(shù)量。CIK-DC細(xì)胞聯(lián)合治療，患者癥狀明顯改善，生活質(zhì)量提高，索拉非尼副反應(yīng)減輕，顯示對不宜進(jìn)行手術(shù)或化療晚期的肝癌患者具有改善癥狀、提高生活質(zhì)量的作用，但遠(yuǎn)期療效及其對患者生存期的影響，仍需長期隨訪。本例在回輸過程中，有2次寒戰(zhàn)、發(fā)熱，無其他明顯不良反應(yīng)，患者發(fā)熱原因可能是在回輸?shù)腄C-CIK懸液中含有IL-2和人血白蛋白之故，均可自行消退，無其他不適，充分說明DC-CIK治療的安全性［8］。這種典型的個性化生物治療模式，具有獨(dú)特的優(yōu)勢和良好的抗腫瘤作用，為肝癌患者的治療提供了新的治療手段。

［1］張有順，黃 玲，楊紅玲，等.肝癌患者CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)及對肝癌細(xì)胞毒作用的研究〔J〕.上海免疫學(xué)雜志，2003，23(3):201.

［2］Banchereaul J，Steinman R.Dendritic cells and the control of immunity〔J〕.Nature，1998，392:245.

［3］Schott M，Seisslar J.Dendritic cell vaccination:new hope for thetreatment of metastasized endocrine malignancies〔J〕.Trends Endocrinal Metab，2003，14(4):156.

［4］鮑 鋒，徐 巖，尹富華，等.CIK細(xì)胞過繼免疫治療中晚期惡性腫瘤的臨床研究〔J〕.遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2003，17(4):187.

［5］Simpson D，Keating GM.Sorafenib:in hepat ocellularcarcinoma〔J〕.Drugs，2008，68(2):251.

［6］杜清友，劉明旭，王福生，等.CIK細(xì)胞體內(nèi)外抗肝癌細(xì)胞應(yīng)用〔J〕.中國癌癥雜志，2001，11(4):325.

［7］Wang QJ，Wang H，Pan K，et al.Comparative study on antitumor immune response of autologous cytokine-induced killer(CIK)cells，dendritic cells-CIK(DC-CIK)，and semi-allogeneic DC-CIK〔J〕.Chin J Cancer，2010，29(7):641.

［8］Shi M，Zhang B，Tang ZR，et al.Autologous cytokine-induced killer(CIK)cell therapy in clinicaltrial phase I is safe in patients with primaryhepatocellular carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2004，10(8):1146.