劉曼華 王 瑩

大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，雌激素在卵巢上皮腫瘤的病程進展中起重要作用。雌激素受體a(estrogen receptor alpha，ERa)是重要的腫瘤抑制基因，體外實驗表明，雌激素受體a表達可抑制細胞增生，具有一定的抗癌作用［1］。雌激素受體(estroqen receptor，ER)是抗雌激素類藥物內(nèi)分泌治療的靶點，也是預(yù)后的重要指標(biāo)［2，3］。

為探討卵巢上皮癌中ERa基因CpG島甲基化狀況及與其生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系，我們采用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)檢測，正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤和卵巢癌組織中ERa基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)，分析卵巢癌ERa啟動子甲基化與其臨床病理特征的關(guān)系，進一步探討ERa啟動子甲基化作為卵巢癌臨床診斷和治療的分子標(biāo)志物的可能性，并為卵巢癌的去甲基化治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科提供新鮮組織標(biāo)本，包括10例正常卵巢組織、20例良性組織和64例卵巢癌組織，經(jīng)病理檢查證實的卵巢癌標(biāo)本64例，其中33例漿液性腺癌(SAC)、20例黏液性癌、9例子宮內(nèi)膜樣腺癌(MAC)、2例透明細胞癌(CCA)。卵巢癌按FIGO 2000標(biāo)準(zhǔn)分期:Ⅰ～Ⅱ期(早期)19例，Ⅲ～Ⅳ期(晚期)45例。病理學(xué)分級:G1～G2級為高分化，共22例，G3級為低分化，共42例。上皮性卵巢癌患者年齡33 ～76歲，平均53.8歲，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。10例正常卵巢組織取自因子宮疾病或卵巢良性病變切除的卵巢組織，患者年齡36～62歲，平均53.2 歲。

1.2 引物、主要試劑和儀器

ERa基因序列號為xM 000125，各個引物序列(表1)見參考文獻［4］，均由上海生物工程公司合成。DNA抽提試劑盒購自德國QIAamp生物技術(shù)有限公司。DNA亞硫酸鈉修飾試劑盒購自美國CHEMICON公司。Hot StarTap酶購自QIAamp生物技術(shù)有限公司。PCR反應(yīng)體系自行配置。野生型引物w擴增未修飾的啟動子區(qū)。非甲基化引物u、甲基化引物m分別擴增經(jīng)修飾后的非甲基化和甲基化啟動子區(qū)。PxZ型PCR擴增儀為 Thermo Hybaid公司產(chǎn)品，BioSens SC620型紫外凝膠分析系統(tǒng)為上海山富科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

表1 ERa基因引物序列及PCR反應(yīng)條件

1.3 PCR 反應(yīng)

1.3.1 DNA提取 新鮮組織標(biāo)本，按DNA抽提試劑盒提取DNA，并測定DNA濃度和含量。

1.3.2 DNA經(jīng)亞硫酸鈉修飾及純化 按照CHEMICON公司的DNA修飾試劑盒試驗程序(Protocal)提示進行:相關(guān)試劑準(zhǔn)備－1.0 μgDNA進行亞硫酸鹽修飾－脫鹽－再次脫鹽并純化－洗脫，最后洗脫DNA溶于30 μl BufferTE 溶液備用。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序 50 μl反應(yīng)體系:MgCl22.0 mmol/L，正向引物和反向引物 0.8 μmol/L，4種dNTP每種終濃度為0.4 mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5 U，DNA 模板1 μg。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃5 min，變性 95℃ 30 s，退火(溫度、時間見參考文獻［4］)，72℃1 min，40個循環(huán);72℃ 8 min延伸，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠分析系統(tǒng)觀察拍照。

1.3.4 PCR產(chǎn)物直接測序 提供啟動子非甲基化引物和甲基化引物的PCR產(chǎn)物，由大連寶生物技術(shù)有限公司純化和直接測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用 χ2檢驗，根據(jù)χ2值計算Pearson列聯(lián)系數(shù)，數(shù)字＜40采用Fisher’s精確法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERa基因啟動子區(qū)甲基化情況

10例正常卵巢組織中未見ERa基因啟動子甲基化;20例卵巢良性腫瘤中ERa基因啟動子甲基化發(fā)生率為10.00%(2/20);64例卵巢癌組織中ERa基因啟動子甲基化發(fā)生率為53.13%(34/64)，ERa基因啟動子甲基化發(fā)生率卵巢癌、卵巢良性腫瘤與正常卵巢組織間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);卵巢癌與卵巢良性腫瘤比較及卵巢良性腫瘤與正常卵巢組織比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

正常組織、良性卵巢組織和卵巢癌組織中均有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，野生型引物(w)、非甲基化引物(u)和甲基化引物(m)的PCR擴增結(jié)果見圖1。

表2 不同卵巢組織中ERa基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)

圖1 不同卵巢組織中ERa基因甲基化表達圖

2.2 ERa基因啟動子甲基化與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

上皮性卵巢癌組織中ERa基因啟動子甲基化發(fā)生率，漿液性癌與黏液性癌比較差異無顯著性(Fisher’s=0.208，P ＞0.05)，內(nèi)膜樣癌中其甲基化率最高，與其他幾種類型比較差異顯著(P＜0.05)。高分化、中分化癌中ERa基因啟動子區(qū)甲基化率顯著低于低分化癌(Fisher’s=0.044，P ＜0.05);但高分化與中分化比較無統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher’s≥0.05，P≥0.05);Ⅰ期、Ⅱ期卵巢癌組織其發(fā)生率顯著低于Ⅲ期和Ⅳ期((Fisher’s=0.019，P ＜0.05)，且腫瘤大小、盆腔淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移與ERa啟動子甲基化無顯著相關(guān)性(P ＞0.05)，見表3。

2.3 ERa基因啟動子甲基化與卵巢癌發(fā)生的關(guān)系

ERa基因啟動子甲基化患者，患卵巢癌的風(fēng)險增加5.68倍;晚期患者ERa基因啟動子甲基化率增高，危險性明顯增大(表3，表4)。

表3 ERa基因啟動子甲基化與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

表4 ERa基因啟動子甲基化與卵巢癌發(fā)生的關(guān)系(例)

3 討論

DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)是被人們最早發(fā)現(xiàn)的1種調(diào)控機制，它與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系。在腫瘤細胞中，異常甲基化最大的特點是全基因組的低甲基化和局部性(CpG島)高甲基化并存［5］。最重要的甲基化堿基是胞嘧啶，通常發(fā)生在啟動子區(qū)CpG島區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)CpG島甲基化可以抑制啟動子序列的基因表達。

上皮性卵巢癌(占卵巢腫瘤的90%)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，臨床上使用標(biāo)準(zhǔn)的或經(jīng)驗治療方法并未降低患者的發(fā)病率或死亡率。大多研究針對卵巢上皮腫瘤及其亞型—漿液性(占80% ～90%)、子宮內(nèi)膜樣、透明細胞癌進行。病理條件下長期過度的雌激素刺激是卵巢癌發(fā)生、病情惡化的重要因素［6，7］。在實驗條件下對抗雌激素及其受體的活性可抑制某些卵巢癌細胞的生長［8］，且已有試驗證明在乳腺癌中，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以恢復(fù)對內(nèi)分泌治療的敏感性［9］。ERa在上皮性卵巢癌病理進程中發(fā)生作用的方式尚不清楚，但已有試驗證明在卵巢癌和交界性卵巢腫瘤中存在ERa基因甲基化現(xiàn)象［10］。

本研究中，檢測64例不同類型的卵巢上皮惡性腫瘤中ERa基因表達情況，對ERa表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系進行分析，觀察到子宮內(nèi)膜樣癌中ERa甲基化陽性率為77.78%，與漿液性卵巢癌有統(tǒng)計學(xué)差異，所以臨床上子宮內(nèi)膜樣癌預(yù)后較漿液性癌差［11］，且為卵巢子宮內(nèi)膜樣癌的內(nèi)分泌治療提供依據(jù)［12］。Fujimura 等［13］同樣觀察到，CCA 中 ERa、PR 的表達均明顯低于其他類型卵巢癌，其中ERa在CCA標(biāo)本及細胞系中的表達均為陰性，這與我們的研究結(jié)果相同，提示CCA與SAC中ERa及PR發(fā)揮作用的方式可能不同，說明ERa基因甲基化是其失活的1種重要機制。卵巢癌中ERa、PR間存在的調(diào)控方式，有待從分子生物學(xué)及細胞學(xué)等方面進一步研究其調(diào)控機制。

本實驗中有2例卵巢良性腫瘤組織發(fā)生甲基化，推測可能有小部分腫瘤細胞有惡變潛能或癌前細胞出現(xiàn)在正常組織中，與Makarla等［14］的研究結(jié)論相一致，并且這些卵巢良性腫瘤或許已經(jīng)有了潛在惡性行為。推測該病例可能存在卵巢癌的危險因素，且可能與早期高雌激素水平的長期暴露有關(guān)，建議定期復(fù)查。

我們研究還發(fā)現(xiàn)，ERa基因啟動子區(qū)甲基化的發(fā)生與細胞分化程度和臨床分期有關(guān)，多發(fā)生在低分化者和臨床Ⅲ、Ⅳ期的患者，而且隨著疾病的進展，這種分子狀態(tài)將持續(xù)存在。高分化組和中分化組ERa基因甲基化的發(fā)生率明顯低于低分化組，提示ERa基因甲基化與卵巢癌的細胞分化程度密切相關(guān)，卵巢癌細胞分化程度越低，ERa基因的甲基化頻率就越高。臨床Ⅰ、Ⅱ期ERa基因甲基化的發(fā)生率也明顯高于低于Ⅲ、Ⅳ期，據(jù)此，可以推測ERa基因是與早期卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要抑癌基因之一，主要由于啟動子區(qū)異常甲基化而導(dǎo)致其表達失活，晚期卵巢癌ERa基因發(fā)生高甲基化導(dǎo)致對抗雌激素藥物的不敏感，這或許可以解釋晚期卵巢癌內(nèi)分泌治療療效差的原因，我們可以設(shè)想對于早期卵巢癌或許內(nèi)分泌治療會得到良好療效。

本實驗檢測卵巢癌組織中ERa基因的發(fā)生甲基化，推測可同時測定循環(huán)腫瘤標(biāo)記物以提高診斷率;而且它們在各種類型的卵巢癌中均達，提示可用于卵巢癌的篩查;我們在研究ERa基因與卵巢癌的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，ERa基因甲基化患者患卵巢癌的風(fēng)險增加5.68倍;且晚期甲基化率明顯增高，提示測這個抑癌基因的異常甲基化可用于卵巢癌的早期臨床診斷。

本研究結(jié)果顯示，ERa啟動子甲基化率與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及腫瘤大小無顯著相關(guān)性，提示ERα基因甲基化與卵巢癌的轉(zhuǎn)移潛能無關(guān)。對于早期卵巢癌的發(fā)生或許與雌激素長期刺激有關(guān)，ERa啟動子甲基化外，或者還有其他一些機制參與，DNA甲基化并不是其蛋白失表達的唯一機制，而是多種機制共同參與的結(jié)果。

總之，我們通過對卵巢腫瘤中ERa基因甲基化的檢測，并結(jié)合臨床病理特征進行初步分析，結(jié)果顯示:子宮內(nèi)膜樣癌與漿液性卵巢間ERa甲基化表達陽性率最高，與其他幾種病理類型存在差異，同時發(fā)現(xiàn)ERa基因甲基化與臨床分期有密切關(guān)系，可能成為臨床治療和評估預(yù)后的一項參考指標(biāo)。由于近年來，應(yīng)用DNA甲基化標(biāo)志進行臨床癌癥檢測和診斷已經(jīng)取得了顯著的進展。檢測ERa啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，因其具有高靈敏度，操作簡便，快速，檢測標(biāo)本要求低等特點，可以作為卵巢癌早期診斷、分型、復(fù)發(fā)的生物學(xué)指標(biāo)，選擇內(nèi)分泌治療的預(yù)測因子以及提高內(nèi)分泌治療有效，也可能成為檢測預(yù)后的一個重要指標(biāo)。去甲基化藥物可以使卵巢癌細胞的ERa恢復(fù)表達，恢復(fù)對抗雌激素療法的敏感性，從而提高卵巢癌內(nèi)分泌治療的有效率［15］。

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