陳 伶 鄧金昆 劉 星 史莉莉 李 麗

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，也是典型的血管依賴性疾病，其發(fā)生、發(fā)展、生長、轉移等均與血管生成密切相關。因此，將血管作為乳腺癌治療的靶點成為研究熱點，抗血管藥物也陸續(xù)被研發(fā)。近幾年研究顯示，一些化療藥物在低濃度劑量下具有抗血管生成作用，提高抗癌效果且不良反應小，不易產生耐藥，將這種給藥方式稱為低劑量節(jié)律化療(low-dose metronomic chemotherapy，LDM)。以往在以傳統(tǒng)的最大耐受量(maximum tolerated dose，MTD)為基礎的化療方案，是通過干擾腫瘤細胞的DNA復制、酶及微管功能或代謝來直接殺滅腫瘤細胞達到抑瘤的效果，因其化療間歇期較長，使正常細胞得以恢復，但同時血管內皮細胞也得以修復，故其抗血管生成作用并沒有帶來良好的療效。本實驗建立裸鼠人乳腺癌模型，將傳統(tǒng)的化療方式MTD與LDM相結合，通過觀察治療后裸小鼠腫瘤組織中TSP-1、MVD及AI表達的變化，以研究環(huán)磷酰胺MTD聯(lián)合LDM的化療方案，對乳腺癌血管生成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MCF-7由大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。BALB/c-nu裸鼠20只，雌性，4～6周齡，體重16～22 g，購于大連醫(yī)科大學動物實驗中心。環(huán)磷酰胺注射液粉劑購于江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體購于美國Biolegend公司，兔抗小鼠TSP-1單克隆抗體購于武漢博士德生物技術有限公司，TUNEL凋亡試劑盒購于南京凱基生物技術有限公司。免疫組化相關試劑盒購于北京中杉生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 將人乳腺癌細胞株MCF-7細胞接種于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，于對數(shù)生長期將其調至細胞濃度為6×107個/ml的MCF-7細胞懸液，按0.2 ml/只接種于裸鼠右側胸壁乳墊下，待腫瘤體積長到150～200 mm3時開始分組用藥。

1.2.2 實驗分組及用藥 將20只荷瘤裸鼠隨機(隨機數(shù)字表法)分成4組，每組5只，A組(LDM單藥組)CTX 20 mg/kg，qd，ip，共 21 d;B 組(LDM+MTD 聯(lián)合組)CTX 150 mg/kg，qod，ip，共 3 次，隔天予 CTX 20 mg/kg，qd，ip，共21 d;C 組(MTD 單藥組)CTX 150 mg/kg，qod，ip，共3 次，共21 d;D 組(生理鹽水組)NS等體積，qd，ip，共 21 d。

1.2.3 組織取材及病理切片檢查 用藥結束采用頸椎脫臼法處死裸鼠，在無菌條件下剝離瘤組織，稱重。瘤標本離體后，15 min內浸泡于10%的中性福爾馬林液中，常溫下固定8～24 h，石蠟包埋，2 μm連續(xù)切片，行HE染色，CD34、TSP-1免疫組織化學染色及TUNEL凋亡檢測(按說明書操作)。

1.2.4 結果評定標準 用藥期間，每周尾靜脈采血計數(shù)外周血白細胞數(shù)，隔天測量腫瘤體積，用游標卡尺測量腫瘤最大直徑(a)及與之相垂直的橫徑(b)，根據(jù)公式V(mm3)=1/2ab2，計算出腫瘤相對體積并繪制腫瘤生長曲線。用藥結束后，脫頸處死裸鼠，稱瘤重，并計算瘤質量抑瘤率，抑瘤率=(對照組重量－實驗組重量)/對照組重量×100%。

MVD 判定:按照 Weidner［1］的微血管判斷標準，低倍鏡確定腫瘤組織內微血管密度最密集的視野(新生血管熱點區(qū))，高倍鏡10×20視野范圍內計數(shù)所有染色的微血管，取4個視野計數(shù)結果的均值。

TSP-1判定:正常的黏膜上皮細胞或腫瘤細胞胞質及細胞間質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性表達判斷標準:①低倍鏡下選染色均勻的腫瘤區(qū)域，在400倍視野下，按著色細胞占視野細胞總數(shù)的百分數(shù)分為3級:無著色細胞為0級(0分);著色細胞數(shù)＜25%為1級(1分);25% ～56%為2級(2分);＞56%為3級(3分)。②按細胞著色強弱分級:0級(0分):不著色;1級(1分):著色弱;2級(2分):中等著色;3級(3分):著色強。根據(jù)上兩項分數(shù)之和判斷:0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為中度陽性，5～6分為強陽性。

TUNEL判定:細胞核內有棕黃色或棕黑色者為凋亡細胞，凋亡程度以凋亡指數(shù)(AI)表示。隨機取5個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞百分率(%)，AI=陽性細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 CTX對腫瘤體積生長的抑制作用

用藥前期，各組腫瘤體積未見明顯差異;隨作用時間延長，各組腫瘤體積逐漸出現(xiàn)差異，B組瘤體積增長速度明顯慢于D組。用藥后期，各用藥組瘤體積增長速度均慢于D組，B組腫瘤體積增長平緩，D組腫瘤生長曲線陡直，低劑量節(jié)律化療組與最大耐受量組間瘤體積無明顯差異(表1，圖1)。用藥第14天D組與各用藥組間比較，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);第21天B組腫瘤體積小于A、C兩組(P＜0.05)。

表1 各組裸鼠用藥后1、7、14、21 d移植瘤體積

圖1 各組裸鼠用藥期間移植瘤生長曲線圖

2.2 瘤重與抑瘤率

結果顯示，各用藥組與D組比較均有統(tǒng)計學意義，B組與A組和C組比較，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，B組瘤質量最小，抑瘤率達69.15%，A組與C組抑瘤率比較無統(tǒng)計學差異(表2)。

表2 治療后各組瘤質量及抑瘤率情況(s，%)

表2 治療后各組瘤質量及抑瘤率情況(s，%)

組別 瘤質量(g)抑瘤率 P值A 組 0.76 ± 0.26 32.95 PAB=0.010，PAC =0.472 B 組 0.35 ± 0.03 69.15 PAD=0.013，PBC=0.041 C 組 0.66 ± 0.19 41.57 PBD=0.000，PCD=0.003 D 組 1.13 ±0.24—

2.3 毒副作用

化療給機體帶來的不良反應主要表現(xiàn)為骨髓抑制、嘔吐、腹瀉等，其中以Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制為主要的、最常見的不良反應。小鼠用藥前后一般狀況良好，各組間白細胞計數(shù)無統(tǒng)計學意義，MTD用藥后細胞數(shù)量呈現(xiàn)出上下浮動趨勢(圖2)，但均在正常值范圍內(小鼠白細胞參考值為4～12×109個/L)?？紤]可能由于傳統(tǒng)最大耐受量的化療方式，大量殺滅了正常白細胞，刺激了機體的自身保護機制，動員骨髓中的未成熟的白細胞進入外周血中。

圖2 小鼠用藥前后白細胞變化情況

2.4 病理檢測結果

2.4.1 MVD結果 本實驗結果顯示，D組MVD陽性表達水平明顯高于各用藥組(表3)。C組MVD表達水平高于A組和B組(P＜0.05)，而A組與B組比較、C組與D組比較均無差異(P＞0.05)。

表3 治療后各組裸鼠移植瘤MVD檢測結果(s)

表3 治療后各組裸鼠移植瘤MVD檢測結果(s)

組別 n(只)MVD數(shù)值(個)P值A 組 5 12.57 ±2.81 PAB=0.525，PAC =0.015 B 組 5 10.67 ±2.25 PAD=0.001，PBC=0.012 C 組 PBD=0.001，PCD=0.208 D組

2.4.2 TSP-1結果 本實驗結果顯示，B組 TSP-1陽性表達水平明顯高于 C、D兩組(P＜0.05)(表4)，A組其表達水平高于C、D兩組(P＜0.05)，A組與B組比較未見差異(P＞0.05)。

表4 治療后各組裸鼠移植瘤TSP-1檢測結果(s)

表4 治療后各組裸鼠移植瘤TSP-1檢測結果(s)

組別 n(只)TSP－1分值 P值A 組 5 3.40 ±0.14 PAB=0.548，PAC =0.021 B 組 5 3.71 ±0.76 PAD=0.004，PBC=0.004 C 組 PBD=0.001，PCD=0.48 D組

2.4.3 TUNEL結果 本實驗結果顯示，B組鏡下凋亡細胞數(shù)目，顯著多于其他用藥組和D組，D組與其他組間比較，AI值均存在差異，AI值B組與A、C組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但C組與A組比較未見差異(P ＞0.05)(表5)。

表5 治療后各組裸鼠移植瘤凋亡指數(shù)(AI)(s，%)

表5 治療后各組裸鼠移植瘤凋亡指數(shù)(AI)(s，%)

A 組 5 6.80 ±0.53 PAB=0.004，PAC =0.666 B 組 5 10.30 ±1.02 PAD=0.030，PBC=0.013 C 組 5 7.30 ±0.50 PBD=0.000，PCD=0.011 D組

2.5 TSP-1、MVD、TUNEL 相關性

統(tǒng)計學結果顯示，裸鼠移植瘤中MVD與TSP-1表達呈負相關性(γ = －0.503，P=0.014)，TSP-1 表達與腫瘤細胞凋亡呈正相關性(γ =0.420，P=0.046)。

3 討論

惡性腫瘤的生長、轉移依賴于腫瘤血管的生成。Hanahan［2］2011年重訴了腫瘤細胞的10個基本特征，其中基因組不穩(wěn)定和突變、持續(xù)的血管生成及回避凋亡均為腫瘤細胞的重要特征。傳統(tǒng)的化療方式主要是以細胞毒性理論為基礎，腫瘤細胞的不穩(wěn)定性，易于突變，很容易使腫瘤細胞產生耐藥性。相對而言，腫瘤血管內皮細胞比較穩(wěn)定，不易發(fā)生突變導致耐藥，因而抗血管生成成為治療乳腺癌的新手段。最大耐受劑量的CTX(MTD)能誘導腫瘤微血管內皮細胞凋亡，但化療周期之間的較長間歇能使大部分受損的血管系統(tǒng)得以恢復，因而不能帶來持久的治療效果［3］。本實驗采用了最大耐受劑量的CTX能誘導腫瘤微血管內皮細胞凋亡的優(yōu)點，摒棄化療周期較長間歇使大部分受損的血管系統(tǒng)得以恢復的缺點，考慮到小劑量節(jié)律化療對機體的不良反應較低，且能夠持續(xù)治療較長時間，故在傳統(tǒng)的最大耐受劑量間歇期給與小劑量節(jié)律化療，在很大程度上增強了殺滅腫瘤細胞和抗血管生成的雙重作用。

環(huán)磷酰胺作為經(jīng)典的化療藥物，屬雙功能烷化劑及細胞周期非特異性藥物，其主要干擾DNA及RNA功能，抑制腫瘤細胞增殖。傳統(tǒng)的化療方案主要是通過抑制腫瘤細胞生長或誘導其凋亡而發(fā)揮作用的，而節(jié)律化療雖對腫瘤細胞也有作用，但主要是通過破壞腫瘤血管而達到抗腫瘤的作用，而TSP-1可能是低劑量環(huán)磷酰胺抗腫瘤作用的潛在因子［4，5］，Hamano 等［6］和Samantha等［7］研究又提出，TSP-1誘導內皮細胞凋亡可產生抗血管生成的作用。乳腺癌經(jīng)典的化療方案中(如CAF、CEF、AC-T等)均使用環(huán)磷酰胺作為基礎藥物，故本實驗采用環(huán)磷酰胺為治療藥物，將傳統(tǒng)的最大耐受量的化療方案與低劑量節(jié)律化療相結合，免疫組化結果證實其上調TSP-1，抑制MVD表達，提高腫瘤細胞凋亡率。因而，我們得出結論，環(huán)磷酰胺MTD聯(lián)合LDM可抗腫瘤血管生成、誘導腫瘤細胞凋亡，并不增強毒副作用;其可能通過上調TSP-1表達，間接達到抑制腫瘤血管生成。

［1］Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density with in breast carcinoma and other solid tumors〔J〕.Breast Cancer Res Treat，1995，36(2):169.

［2］Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation〔J〕.Cell，2011，144(5):646.

［3］Man S，Bocci G，F(xiàn)rancia G.Antitumor effects in mice of lowdose cyclophosphamide administered continuously through the drinking water〔J〕.Cancer Res，2002，62(10):2731.

［4］Bocci G，F(xiàn)rancia G，Man S.Thrombospondin-1，amediator of the antiangiogenic effects of low-dose metronomic chemotherapy〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2003，100(22):12917.

［5］王 云，梁憲斌，紀媛媛，等.環(huán)磷酰胺節(jié)律化療的抗血管生成作用探討〔J〕.山東醫(yī)藥，2006，46(6):17.

［6］Hamano Y，Sugimoto H，Soubasakos MA，et al.Thrombospondin-1 associated with tumor microenvironment contributes to low-dose cyclophosphamide-mediated endothelial cell apoptosis and tumor growth suppression〔J〕.Cancer Res，2004，64(5):1570.

［7］Samantha AG，Christopher RH，Stephen GH，et al.Thrombospond-1 inhibits angiogenesis and promotes follicular atresia in a novel in vitro angiogenesis assay〔J〕.Endocrinology，2010，151(3):1280.