陳 伶 鄧金昆 劉 星 史莉莉 李 麗

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是典型的血管依賴性疾病，其發(fā)生、發(fā)展、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等均與血管生成密切相關(guān)。因此，將血管作為乳腺癌治療的靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)，抗血管藥物也陸續(xù)被研發(fā)。近幾年研究顯示，一些化療藥物在低濃度劑量下具有抗血管生成作用，提高抗癌效果且不良反應(yīng)小，不易產(chǎn)生耐藥，將這種給藥方式稱為低劑量節(jié)律化療(low-dose metronomic chemotherapy，LDM)。以往在以傳統(tǒng)的最大耐受量(maximum tolerated dose，MTD)為基礎(chǔ)的化療方案，是通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制、酶及微管功能或代謝來(lái)直接殺滅腫瘤細(xì)胞達(dá)到抑瘤的效果，因其化療間歇期較長(zhǎng)，使正常細(xì)胞得以恢復(fù)，但同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞也得以修復(fù)，故其抗血管生成作用并沒(méi)有帶來(lái)良好的療效。本實(shí)驗(yàn)建立裸鼠人乳腺癌模型，將傳統(tǒng)的化療方式MTD與LDM相結(jié)合，通過(guò)觀察治療后裸小鼠腫瘤組織中TSP-1、MVD及AI表達(dá)的變化，以研究環(huán)磷酰胺MTD聯(lián)合LDM的化療方案，對(duì)乳腺癌血管生成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。BALB/c-nu裸鼠20只，雌性，4～6周齡，體重16～22 g，購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。環(huán)磷酰胺注射液粉劑購(gòu)于江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司，兔抗小鼠TSP-1單克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，TUNEL凋亡試劑盒購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)有限公司。免疫組化相關(guān)試劑盒購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 將人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期將其調(diào)至細(xì)胞濃度為6×107個(gè)/ml的MCF-7細(xì)胞懸液，按0.2 ml/只接種于裸鼠右側(cè)胸壁乳墊下，待腫瘤體積長(zhǎng)到150～200 mm3時(shí)開(kāi)始分組用藥。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及用藥 將20只荷瘤裸鼠隨機(jī)(隨機(jī)數(shù)字表法)分成4組，每組5只，A組(LDM單藥組)CTX 20 mg/kg，qd，ip，共 21 d;B 組(LDM+MTD 聯(lián)合組)CTX 150 mg/kg，qod，ip，共 3 次，隔天予 CTX 20 mg/kg，qd，ip，共21 d;C 組(MTD 單藥組)CTX 150 mg/kg，qod，ip，共3 次，共21 d;D 組(生理鹽水組)NS等體積，qd，ip，共 21 d。

1.2.3 組織取材及病理切片檢查 用藥結(jié)束采用頸椎脫臼法處死裸鼠，在無(wú)菌條件下剝離瘤組織，稱重。瘤標(biāo)本離體后，15 min內(nèi)浸泡于10%的中性福爾馬林液中，常溫下固定8～24 h，石蠟包埋，2 μm連續(xù)切片，行HE染色，CD34、TSP-1免疫組織化學(xué)染色及TUNEL凋亡檢測(cè)(按說(shuō)明書(shū)操作)。

1.2.4 結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 用藥期間，每周尾靜脈采血計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞數(shù)，隔天測(cè)量腫瘤體積，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑(a)及與之相垂直的橫徑(b)，根據(jù)公式V(mm3)=1/2ab2，計(jì)算出腫瘤相對(duì)體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。用藥結(jié)束后，脫頸處死裸鼠，稱瘤重，并計(jì)算瘤質(zhì)量抑瘤率，抑瘤率=(對(duì)照組重量－實(shí)驗(yàn)組重量)/對(duì)照組重量×100%。

MVD 判定:按照 Weidner［1］的微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)，低倍鏡確定腫瘤組織內(nèi)微血管密度最密集的視野(新生血管熱點(diǎn)區(qū))，高倍鏡10×20視野范圍內(nèi)計(jì)數(shù)所有染色的微血管，取4個(gè)視野計(jì)數(shù)結(jié)果的均值。

TSP-1判定:正常的黏膜上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn):①低倍鏡下選染色均勻的腫瘤區(qū)域，在400倍視野下，按著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)分為3級(jí):無(wú)著色細(xì)胞為0級(jí)(0分);著色細(xì)胞數(shù)＜25%為1級(jí)(1分);25% ～56%為2級(jí)(2分);＞56%為3級(jí)(3分)。②按細(xì)胞著色強(qiáng)弱分級(jí):0級(jí)(0分):不著色;1級(jí)(1分):著色弱;2級(jí)(2分):中等著色;3級(jí)(3分):著色強(qiáng)。根據(jù)上兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和判斷:0分為陰性，1～2分為弱陽(yáng)性，3～4分為中度陽(yáng)性，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性。

TUNEL判定:細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色或棕黑色者為凋亡細(xì)胞，凋亡程度以凋亡指數(shù)(AI)表示。隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率(%)，AI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 CTX對(duì)腫瘤體積生長(zhǎng)的抑制作用

用藥前期，各組腫瘤體積未見(jiàn)明顯差異;隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，各組腫瘤體積逐漸出現(xiàn)差異，B組瘤體積增長(zhǎng)速度明顯慢于D組。用藥后期，各用藥組瘤體積增長(zhǎng)速度均慢于D組，B組腫瘤體積增長(zhǎng)平緩，D組腫瘤生長(zhǎng)曲線陡直，低劑量節(jié)律化療組與最大耐受量組間瘤體積無(wú)明顯差異(表1，圖1)。用藥第14天D組與各用藥組間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);第21天B組腫瘤體積小于A、C兩組(P＜0.05)。

表1 各組裸鼠用藥后1、7、14、21 d移植瘤體積

圖1 各組裸鼠用藥期間移植瘤生長(zhǎng)曲線圖

2.2 瘤重與抑瘤率

結(jié)果顯示，各用藥組與D組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組與A組和C組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，B組瘤質(zhì)量最小，抑瘤率達(dá)69.15%，A組與C組抑瘤率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

表2 治療后各組瘤質(zhì)量及抑瘤率情況(s，%)

表2 治療后各組瘤質(zhì)量及抑瘤率情況(s，%)

組別 瘤質(zhì)量(g)抑瘤率 P值A(chǔ) 組 0.76 ± 0.26 32.95 PAB=0.010，PAC =0.472 B 組 0.35 ± 0.03 69.15 PAD=0.013，PBC=0.041 C 組 0.66 ± 0.19 41.57 PBD=0.000，PCD=0.003 D 組 1.13 ±0.24—

2.3 毒副作用

化療給機(jī)體帶來(lái)的不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為骨髓抑制、嘔吐、腹瀉等，其中以Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制為主要的、最常見(jiàn)的不良反應(yīng)。小鼠用藥前后一般狀況良好，各組間白細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MTD用藥后細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)出上下浮動(dòng)趨勢(shì)(圖2)，但均在正常值范圍內(nèi)(小鼠白細(xì)胞參考值為4～12×109個(gè)/L)?？紤]可能由于傳統(tǒng)最大耐受量的化療方式，大量殺滅了正常白細(xì)胞，刺激了機(jī)體的自身保護(hù)機(jī)制，動(dòng)員骨髓中的未成熟的白細(xì)胞進(jìn)入外周血中。

圖2 小鼠用藥前后白細(xì)胞變化情況

2.4 病理檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 MVD結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D組MVD陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于各用藥組(表3)。C組MVD表達(dá)水平高于A組和B組(P＜0.05)，而A組與B組比較、C組與D組比較均無(wú)差異(P＞0.05)。

表3 治療后各組裸鼠移植瘤MVD檢測(cè)結(jié)果(s)

表3 治療后各組裸鼠移植瘤MVD檢測(cè)結(jié)果(s)

組別 n(只)MVD數(shù)值(個(gè))P值A(chǔ) 組 5 12.57 ±2.81 PAB=0.525，PAC =0.015 B 組 5 10.67 ±2.25 PAD=0.001，PBC=0.012 C 組 PBD=0.001，PCD=0.208 D組

2.4.2 TSP-1結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組 TSP-1陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于 C、D兩組(P＜0.05)(表4)，A組其表達(dá)水平高于C、D兩組(P＜0.05)，A組與B組比較未見(jiàn)差異(P＞0.05)。

表4 治療后各組裸鼠移植瘤TSP-1檢測(cè)結(jié)果(s)

表4 治療后各組裸鼠移植瘤TSP-1檢測(cè)結(jié)果(s)

組別 n(只)TSP－1分值 P值A(chǔ) 組 5 3.40 ±0.14 PAB=0.548，PAC =0.021 B 組 5 3.71 ±0.76 PAD=0.004，PBC=0.004 C 組 PBD=0.001，PCD=0.48 D組

2.4.3 TUNEL結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組鏡下凋亡細(xì)胞數(shù)目，顯著多于其他用藥組和D組，D組與其他組間比較，AI值均存在差異，AI值B組與A、C組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但C組與A組比較未見(jiàn)差異(P ＞0.05)(表5)。

表5 治療后各組裸鼠移植瘤凋亡指數(shù)(AI)(s，%)

表5 治療后各組裸鼠移植瘤凋亡指數(shù)(AI)(s，%)

A 組 5 6.80 ±0.53 PAB=0.004，PAC =0.666 B 組 5 10.30 ±1.02 PAD=0.030，PBC=0.013 C 組 5 7.30 ±0.50 PBD=0.000，PCD=0.011 D組

2.5 TSP-1、MVD、TUNEL 相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，裸鼠移植瘤中MVD與TSP-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(γ = －0.503，P=0.014)，TSP-1 表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)性(γ =0.420，P=0.046)。

3 討論

惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管的生成。Hanahan［2］2011年重訴了腫瘤細(xì)胞的10個(gè)基本特征，其中基因組不穩(wěn)定和突變、持續(xù)的血管生成及回避凋亡均為腫瘤細(xì)胞的重要特征。傳統(tǒng)的化療方式主要是以細(xì)胞毒性理論為基礎(chǔ)，腫瘤細(xì)胞的不穩(wěn)定性，易于突變，很容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。相對(duì)而言，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞比較穩(wěn)定，不易發(fā)生突變導(dǎo)致耐藥，因而抗血管生成成為治療乳腺癌的新手段。最大耐受劑量的CTX(MTD)能誘導(dǎo)腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但化療周期之間的較長(zhǎng)間歇能使大部分受損的血管系統(tǒng)得以恢復(fù)，因而不能帶來(lái)持久的治療效果［3］。本實(shí)驗(yàn)采用了最大耐受劑量的CTX能誘導(dǎo)腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的優(yōu)點(diǎn)，摒棄化療周期較長(zhǎng)間歇使大部分受損的血管系統(tǒng)得以恢復(fù)的缺點(diǎn)，考慮到小劑量節(jié)律化療對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)較低，且能夠持續(xù)治療較長(zhǎng)時(shí)間，故在傳統(tǒng)的最大耐受劑量間歇期給與小劑量節(jié)律化療，在很大程度上增強(qiáng)了殺滅腫瘤細(xì)胞和抗血管生成的雙重作用。

環(huán)磷酰胺作為經(jīng)典的化療藥物，屬雙功能烷化劑及細(xì)胞周期非特異性藥物，其主要干擾DNA及RNA功能，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。傳統(tǒng)的化療方案主要是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)其凋亡而發(fā)揮作用的，而節(jié)律化療雖對(duì)腫瘤細(xì)胞也有作用，但主要是通過(guò)破壞腫瘤血管而達(dá)到抗腫瘤的作用，而TSP-1可能是低劑量環(huán)磷酰胺抗腫瘤作用的潛在因子［4，5］，Hamano 等［6］和Samantha等［7］研究又提出，TSP-1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生抗血管生成的作用。乳腺癌經(jīng)典的化療方案中(如CAF、CEF、AC-T等)均使用環(huán)磷酰胺作為基礎(chǔ)藥物，故本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺為治療藥物，將傳統(tǒng)的最大耐受量的化療方案與低劑量節(jié)律化療相結(jié)合，免疫組化結(jié)果證實(shí)其上調(diào)TSP-1，抑制MVD表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞凋亡率。因而，我們得出結(jié)論，環(huán)磷酰胺MTD聯(lián)合LDM可抗腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并不增強(qiáng)毒副作用;其可能通過(guò)上調(diào)TSP-1表達(dá)，間接達(dá)到抑制腫瘤血管生成。

［1］Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density with in breast carcinoma and other solid tumors〔J〕.Breast Cancer Res Treat，1995，36(2):169.

［2］Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation〔J〕.Cell，2011，144(5):646.

［3］Man S，Bocci G，F(xiàn)rancia G.Antitumor effects in mice of lowdose cyclophosphamide administered continuously through the drinking water〔J〕.Cancer Res，2002，62(10):2731.

［4］Bocci G，F(xiàn)rancia G，Man S.Thrombospondin-1，amediator of the antiangiogenic effects of low-dose metronomic chemotherapy〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2003，100(22):12917.

［5］王 云，梁憲斌，紀(jì)媛媛，等.環(huán)磷酰胺節(jié)律化療的抗血管生成作用探討〔J〕.山東醫(yī)藥，2006，46(6):17.

［6］Hamano Y，Sugimoto H，Soubasakos MA，et al.Thrombospondin-1 associated with tumor microenvironment contributes to low-dose cyclophosphamide-mediated endothelial cell apoptosis and tumor growth suppression〔J〕.Cancer Res，2004，64(5):1570.

［7］Samantha AG，Christopher RH，Stephen GH，et al.Thrombospond-1 inhibits angiogenesis and promotes follicular atresia in a novel in vitro angiogenesis assay〔J〕.Endocrinology，2010，151(3):1280.