全 紅，張 茜，陳 璇，白小紅 (山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，太原 030001;通訊作者:Tel:0351－4690071;E－mail:bxh246@163.com)

黃酮類化合物(flavonoids compounds)具有廣譜的藥理活性如抗菌、消炎、降壓、抗氧化、抗癌、防癌等作用。種類繁多，廣泛存在于在蔬菜、水果、牧草及藥用植物中。目前，黃酮類化合物的提取方法不僅費(fèi)時(shí)，有機(jī)溶劑用量大，濃縮倍數(shù)小，而且提取到的有效成分較復(fù)雜，不利于中藥中黃酮類化合物尤其是少量或微量黃酮類活性成分的分析和研究。中空纖維液相微萃取(hollow fiber liquid phase mircroextraction，HFLPME)技術(shù)于 1996年由 Jeannot和Cantwell提出［1］，具有有機(jī)溶劑用量少、簡單、快速、富集倍數(shù)高、樣品凈化能力強(qiáng)，集提取、分離、濃縮于一體，并能適應(yīng)復(fù)雜介質(zhì)，痕量成分，特殊性質(zhì)成分分析。HFLPME已經(jīng)被成功地應(yīng)用于環(huán)境分析［2，3］、飲料分析［4］、生物樣品分析［5，6］和中藥樣品分析［7，8］中。本文以二氫楊梅素(dihydromyricetin)、楊梅素(myricetin)、漆黃素(fisetin)、槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、山柰素(kaempferide)、異鼠李素(isorhamnetin)和白楊素(chrysin)黃酮類化合物為模型化合物，以HFLPME作為中藥樣品的前處理技術(shù)，結(jié)合HPLC法成功地同時(shí)測定了中藥側(cè)柏中微量楊梅素、槲皮素、山柰素和白楊素成分的含量。

1 儀器、材料和試劑

1.1 儀器和材料 Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀。

聚偏氟乙烯(MOF 503，內(nèi)徑/外徑:0.5/0.8 mm，孔徑:0.2 μm)，聚醚砜(UEIS 503，內(nèi)徑/外徑:0.8/1.3 mm，孔徑:0.2 μm)和聚砜(UPIS 503，內(nèi)徑/外徑:0.8/1.2 mm，孔徑:0.2 μm)中空纖維均購自天津膜天膜工程技術(shù)有限公司，聚丙烯(PP內(nèi)徑/外徑:0.55/1.2 mm，孔徑:0.18 μm)中空纖維由天津大學(xué)海水淡化與膜技術(shù)中心提供。

1.2 試劑 槲皮素(批號:081－9003)和白楊素(批號:111701－200501)對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，山柰素(批號:A0129)、楊梅素(批號:A0048)對照品由成都曼思特有限公司提供。側(cè)柏購于太原市長城藥店，產(chǎn)于山西運(yùn)城地區(qū)。甲醇(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司，色譜純)，乙腈(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司，色譜純)，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分離條件 采用 Eclipse XDB－C18柱(5 μm，150 mm × 4.6 mm i.d.，Agilent公司)，檢測波長為300 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μl，流動(dòng)相乙腈(A)－ 甲醇(B)－0.3%磷酸(C)用 0.45 μm 微孔濾膜過濾。梯度洗脫程序:0－3 min，35%B+65%C，1 ml/min;3－5 min，47%B+53%C，1 ml/min;5－8 min，26%A+21%B+53%C，0.6 ml/min;8－12 min，47%B+53%C，0.8 ml/min;12－15 min，60%B+40%C，1 ml/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取一定量的對照品，配制二氫楊梅素、楊梅素、漆黃素、柚皮素和白楊素 600 μg/ml，槲皮素和山柰素 750 μg/ml，異鼠李素200 μg/ml的甲醇的對照品儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱保存。使用前用10－5mol/L鹽酸配制成各黃酮類化合物濃度為5 μg/ml萃取混合工作液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取干燥側(cè)柏藥材，研細(xì)，過60目篩，精密稱取3份各1 g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇20 ml，稱重，浸泡10 min，超聲提取(功率100 W)30 min，于室溫下用甲醇補(bǔ)足減失的重量。再加入5 ml 25%的HCl，回流30 min，冷卻至室溫后過濾，用甲醇定容至25 ml，待用。使用前取上述溶液10 ml于100 ml容量瓶中，用10－5mol/L鹽酸稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3 HFLPME實(shí)驗(yàn)步驟 將長約10 cm的聚偏氟乙烯中空纖維管用甲醇超聲洗凈吹干浸入正己醇30 s，待其孔隙充滿正己醇后取出，然后將中空纖維折成U形，用注射器在纖維中注入正己醇。將中空纖維表面的正己醇擦干，并將其浸入到盛有5 ml微萃取混合工作液或樣品工作液的小玻璃瓶中。開啟磁力攪拌器，在1 500 r/min攪拌速度下萃取45 min，萃取結(jié)束后收集接受相于小燒杯中，并將正己醇揮干，加入50 μl甲醇溶解，進(jìn)行HPLC分析。

2.4 HFLPME條件的優(yōu)化

2.4.1 中空纖維種類對萃取效率的影響 考察了聚砜(UPIS503)、聚醚砜(UEIS 503)、聚偏氟乙烯(MOF503)和聚丙烯(PP)4種中空纖維作為有機(jī)溶劑載體對黃酮類化合物萃取效果的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知MOF503聚偏氟乙烯中空纖維萃取效率最高，因此本試驗(yàn)選用MOF503中空纖維作為有機(jī)溶劑支持體。

圖1 中空纖維種類對萃取效率的影響Fig 1 Effect of hollow fiber types on the extraction efficiency

2.4.2 有機(jī)溶劑種類對萃取效率的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇和正癸醇等作為萃取相對黃酮類化合物萃取效率的影響。結(jié)果表明:正己醇較其他正構(gòu)醇萃取效果稍好(見圖2)。故有機(jī)溶劑選擇正己醇。

圖2 醇的種類對萃取效率的影響Fig 2 Effect of alcohol types on the extraction efficiency

2.4.3 供相溶液酸度對萃取效率的影響 由于黃酮類化合物為弱酸性，因此在供相中加入適當(dāng)?shù)乃嵊欣诜治鑫镆苑肿訝顟B(tài)存在，增加其在有機(jī)相中的溶解度。本實(shí)驗(yàn)考察了在供相中加入不同濃度的鹽酸對黃酮類化合物萃取效率的影響(見圖3)。結(jié)果表明:當(dāng)加入鹽酸濃度為10－5mol/L時(shí)，黃酮類化合物萃取效果最好。故在供相中加入10－5mol/L鹽酸。

圖3 鹽酸濃度對萃取效率的影響Fig 3 Effect of HCl concentration on the extraction efficiency

2.4.4 攪拌速度對萃取效率的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了300，600，900，1 200，1 500 和1 800 r/min 時(shí)黃酮類化合物的萃取效率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)攪拌速度為1 500 r/min時(shí)，黃酮類化合物的萃取效率最大。故將攪拌速度確定為1 500 r/min。

圖4 攪拌速度對萃取效率的影響Fig 4 Effect of stirring rate on the extraction efficiency

2.4.5 萃取時(shí)間對萃取效率的影響 液相微萃取過程是一個(gè)基于分析物在供相與有機(jī)相之間分配平衡的過程，分析物在萃取達(dá)平衡時(shí)，萃取效率最高。本實(shí)驗(yàn)考察了萃取時(shí)間分別為 15，30，45，60，90 min和120 min時(shí)黃酮類化合物的萃取效率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，黃酮類化合物隨著萃取時(shí)間延長萃取效率增加，在45 min時(shí)萃取基本達(dá)平衡。因此本試驗(yàn)選擇萃取時(shí)間為45 min。

2.4.6 供相體積對萃取效率的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了不同供相體積對分析物萃取效率的影響，見圖6。由圖6可知，黃酮類化合物在供相體積為5 ml時(shí)，萃取效率最大。故本實(shí)驗(yàn)選擇供相體積為5 ml。

3 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

3.1 工作曲線的繪制 精密量取不同體積的混合工作液，制成分析物濃度分別為 0.01，0.05，0.1，0.3，0.5，1，5，10 μg/ml的系列溶液，按照 HFLPME實(shí)驗(yàn)步驟操作，HPLC檢測，利用色譜峰面積y對分析物濃度c(mg/L)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

圖5 萃取時(shí)間對萃取效率的影響Fig 5 Effect of extraction time on the extraction efficiency

圖6 供相體積對萃取效率的影響Fig 6 Effect of donor phase volume on the extraction efficiency

表1 HFLPME-HPLC測定黃酮類化合物的工作曲線參數(shù) (n=8)Tab 1 Parameters for determining the flavonoids compounds by HFLPME-HPLC (n=8)

3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 分別準(zhǔn)確吸取一定體積的混合工作液，制成 5.00，0.50，0.05 μg/ml高、中、低三種濃度的溶液，按照HFLPME實(shí)驗(yàn)步驟平行測定3次，日內(nèi)精密度RSD＜8.0%，連續(xù)測定3 d，日間精密度 RSD＜10.0%。

3.3 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取5份已知準(zhǔn)確含量的側(cè)柏樣品各1.00 g，準(zhǔn)確加入不同量的對照品溶液，按照供試品溶液制備方法配制成加樣回收率供試品溶液，按HFLPME實(shí)驗(yàn)步驟操作，平行萃取5次，側(cè)柏中分析物的加樣回收率見表2。

3.4 樣品分析 按照2.3.3配制供試品溶液，經(jīng)HFLPME－HPLC測得側(cè)柏中微量黃酮類化合物的含量見表3，樣品色譜圖見圖7。

4 結(jié)論

本文利用HFLPME作為中藥的樣品前處理技術(shù)，結(jié)合HPLC成功地測定中藥側(cè)柏中微量黃酮化合物楊梅素、槲皮素、山奈素和白楊素含量。HFLPME－HPLC操作簡單、快速、富集倍數(shù)高、靈敏度高、凈化能力強(qiáng)、有機(jī)溶劑用量少。該法的成功應(yīng)用對常規(guī)前處理方法難以分析的少量、微量活性成分或有害成分的分析具有重要的意義。另外，聚偏氟乙烯中富電子的F與分析物中缺電子的苯環(huán)(取代基的吸電子影響)極易形成電荷轉(zhuǎn)移超分子，使得被分析物在中空纖維膜表面聚集，增加了分析物在中空纖維表面的有效濃度，提高了分析物的萃取效率和濃縮倍數(shù)。因此，聚偏氟乙烯纖維在液相微萃取中的應(yīng)用，不僅起到了有機(jī)溶劑支持體和微孔過濾的作用，而且還參與了分析物的萃取，對分析物的濃縮和萃取效率提高有一定貢獻(xiàn)。

表2 側(cè)柏中HFLPME-HPLC黃酮類化合物的加樣回收率 (n=5)Tab 2 The sample recovery of flavonoids in Platycladus orientalis by HFLPME-HPLC (n=5)

表3 HFLPME-HPLC快速測定中藥側(cè)柏中微量黃酮類化合物含量Tab 3 Rapid determination of trace of flavonoids compounds in Platycladus orientalis by HFLPME-HPLC

圖7 側(cè)柏樣品色譜圖Fig 7 Chromatogram of Platycladus orientalis samples

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