李俊平，楊承槐，李啟紅，夏業(yè)才，黃建華，陳永忠

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.西寧市畜牧獸醫(yī)站，西寧 810007)

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviridae)科，正反轉(zhuǎn)錄(Orthoretrovirinae)亞科，γ反轉(zhuǎn)錄病毒(Gammaretrovirus)(國際病毒分類委員會2008年病毒分類，http://www.ictvonline.org/virus Taxonomy.asp?version=2008)。該屬包括禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)、雞合胞體病毒(Chicken syncytial virus，CSV)和 Trager鴨脾壞死病毒(Trager duck spleen necrosis virus，TDSNV)，引起的疾病統(tǒng)稱為網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis，RE)。發(fā)病主要表現(xiàn)為免疫抑制、生長抑制(矮小)、網(wǎng)狀細(xì)胞瘤、淋巴組織和其他組織慢性腫瘤［1］。迄今尚無用于免疫預(yù)防該病的疫苗。

接種污染REV的疫苗可引起嚴(yán)重的免疫抑制［2-4］，常常導(dǎo)致對其他疫苗的免疫失敗。早在70年代，國外就有REV污染禽用疫苗的報(bào)道［5］?！稓W洲藥典》和《英國藥典(獸藥)》規(guī)定對生產(chǎn)禽源疫苗的種毒和生產(chǎn)原材料(主要是SPF雞胚)需進(jìn)行REV污染的專項(xiàng)檢測 ?！度毡巨r(nóng)林水產(chǎn)省獸醫(yī)生物制品標(biāo)準(zhǔn)》要求對禽源病毒類活疫苗成品進(jìn)行REV污染的專項(xiàng)檢測，檢測方法為免疫熒光法。我國《獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇版)有關(guān)外源病毒檢驗(yàn)的規(guī)定中，雞檢查法需檢測REV抗體［8］，但雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法均無法有效檢出REV污染。為更好地控制和提高我國獸用生物制品質(zhì)量，亟待建立適合我國實(shí)際國情的禽源活疫苗中污染REV的間接免疫熒光(IFA)檢測方法。因此，需要制備及標(biāo)定雞抗REV的血清，從而為建立IFA法檢測疫苗中REV污染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)HA9901株，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授惠贈;MDV(HVT)、FPV、IBDV、RAV-1、RAV-2，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存;MDV(CVI988)、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒，企業(yè)疫苗毒。

1.1.2 REV 單克隆抗體 11B18，11B54，細(xì)胞培養(yǎng)上清。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授惠贈。

1.1.3 熒光二抗 羊抗鼠IgG熒光抗體、兔抗雞IgY熒光抗體均購自SIGMA公司。

1.1.4 雞抗體 ELISA檢測試劑盒 IBV抗體、IBDV抗體、CAV抗體、ILTV抗體、AEV抗體、REO抗體檢測試劑盒，均購自IDEXX公司。

1.1.5 抗體檢測用其他試劑 AI(H5)、AI(H7)、AI(H9)抗體HI效價測定抗原，哈爾濱獸醫(yī)研究所禽流感參考實(shí)驗(yàn)室提供;NDV、EDSV抗體HI效價測定抗原，IBDV、FAdV、FPV、MDV抗體瓊脂擴(kuò)散抗原，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備。

1.1.6 SPF雞 3周齡，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.1.7 細(xì)胞培養(yǎng)液 M199培養(yǎng)液購自GIBCO公司，小牛血清購自民海生物公司。

1.2 方法

1.2.1 血清制備

1.2.1.1 REV繁殖與濃縮 取REV HA9901株接種于長成單層的 CEF，37℃吸附1 h，加入含1%FCS的M199 8 mL，37℃培養(yǎng)。每隔3～5 d按照常規(guī)方法對細(xì)胞進(jìn)行傳代，第4代(P4)培養(yǎng)72 h分別收集上清和細(xì)胞，細(xì)胞反復(fù)凍融3次，2 000 g離心10 min，收集上清。上清4℃，30 000 g離心2 h，沉淀用病毒液1/10體積的 PBS(1/15 mol/L，pH 7.2)溶解濃縮。用REV單克隆抗體通過間接免疫熒光法測定濃縮前后REV的病毒。

1.2.1.2 免疫及采血 濃縮后的REV經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼和肌肉注射途徑接種SPF雞30只，0.5 mL/只，隔離器中飼養(yǎng)。14 d后加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫后28 d，經(jīng)心臟無菌采集血液，分離血清，每只雞血清留取小樣后混合待檢。

1.2.2 血清檢定

1.2.2.1 特異性檢定

1.2.2.1.1 ELISA 抗體檢測 應(yīng)用 ELISA 法檢測IBV抗體、IBDV抗體、CAV抗體、ILTV抗體、AEV抗體、REO抗體、ALV(AB亞群)抗體、ALV(J亞群)抗體。

1.2.2.1.2 HI抗體檢測 應(yīng)用 HI法檢測 AIV(H5)、AIV(H7)、AIV(H9)、NDV、EDSV 抗體。

1.2.2.1.3 瓊擴(kuò)抗體檢測 應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散法檢測IBDV、FAdV、FPV、MDV 抗體。

1.2.2.1.4 間接免疫熒光抗體檢測 制備的血清進(jìn)行1∶500稀釋，通過間接免疫熒光方法對MDV(HVT)、MDV(CVI988)、FPV、IBDV、RAV-1、RAV-2、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒抗體進(jìn)行檢測。

1.2.2.2 間接免疫熒光效價測定 將制備的REV抗血清用 PBS(1/15 mol/L，pH 7.2)進(jìn)行 1 ∶250、1∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000 稀釋，按照擬定的方法進(jìn)行間接免疫熒光染色。

1.2.3 雞抗 REV血清與單克隆抗體 IFA檢測REV的染色效果比較 分別用自制血清和單克隆抗體經(jīng)IFA檢測REV感染原代CEF后的染色情況和感染REV的CEF傳代后的染色情況。

2 結(jié)果

2.1 制備血清用REV接種劑量 通過離心法濃縮繁殖的REV，濃縮前病毒含量為104.5TCID50/0.1 mL，濃縮后病毒含量為104.8TCID50/0.1 mL。雖然，離心濃縮效果沒有達(dá)到理論值(濃縮10倍)，但是離心沉淀用PBS溶解，可以減少原來細(xì)胞培養(yǎng)液中有機(jī)成分對免疫動物的非特異性刺激，有利于降低抗血清用于IFA染色時的非特異性染色。最終制備出600 mL雞抗REV血清。

2.2 血清特異性檢定 應(yīng)用 ELISA、IFA、AGP、HI等方法對制備的血清進(jìn)行檢測，未檢出禽類常見的17種(或亞型)病毒的抗體，該血清具有良好的特異性。結(jié)果如表1所示。

表1 不同病毒抗體檢測方法及結(jié)果匯總

2.3 血清間接免疫熒光效價測定 將制備的REV抗血清用 PBS(1/15 mol/L，pH 7.2)進(jìn)行1∶250、1∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000 稀釋，按照擬定的方法進(jìn)行間接免疫熒光染色。結(jié)果1∶250、1∶500稀釋度染色正常細(xì)胞對照背景過重;1∶1 000、1∶2 000稀釋度染色 REV 陽性對照清晰，正常細(xì)胞對照背景合適;1∶4 000稀釋度染色陰性，所以該批血清的IFA抗體效價為1∶2 000?？紤]到在保存和使用中可能造成抗體效價下降，根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，綜合評價確定，該批REV抗血清用于間接免疫熒光試驗(yàn)時稀釋度為1∶1 000。代表稀釋度血清用于IFA染色的圖片如圖1～圖6所示。

2.4 雞抗REV血清與單克隆抗體IFA檢測REV的染色效果比較 為了驗(yàn)證自制血清用作REV IFA檢測的特異性，分別用自制血清和單克隆抗體經(jīng)IFA檢測REV感染原代CEF后的染色情況和感染REV的CEF傳代后的染色情況。結(jié)果顯示，原代細(xì)胞中容易找到典型的梭狀細(xì)胞，感染細(xì)胞的核區(qū)明顯(淡染);但細(xì)胞傳代后形態(tài)多為不規(guī)則型，陽性細(xì)胞核區(qū)不明顯。與雞抗REV血清染色結(jié)果相比，單抗染色圖片背景色更弱，核區(qū)更明顯(圖7～圖10)。

圖1 1∶500稀釋度IFA照片

3 討論與結(jié)論

免疫熒光法是REV感染的常用檢測方法，該方法方便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，易于掌握。染色用抗體的特異性是影響染色效果和檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素。

本試驗(yàn)制備了1批雞抗REV血清，經(jīng)檢測，血清中未檢出禽流感病毒抗體(H5、H7、H9亞型)、馬立克氏病病毒抗體、新城疫病毒抗體、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒抗體、禽腺病毒(Ⅰ群)抗體、傳染性支氣管炎病毒抗體、傳染性喉氣管炎病毒抗體、禽腦脊髓炎病毒抗體、傳染性法氏囊病病毒抗體、雞痘病毒抗體、禽白血病病毒AB亞群抗體、禽白血病病毒J亞群抗體、禽呼腸孤病毒抗體、鴨瘟病毒抗體、小鵝瘟病毒抗體，具有良好的單一特異性。間接免疫熒光抗體效價為1∶2 000，綜合考慮確定該批血清用于間接免疫熒光試驗(yàn)時1∶1 000稀釋作為一抗。該批血清通過IFA用于REV檢測時，染色效果與REV單抗相當(dāng)，可以用于REV檢測。

本試驗(yàn)制備和檢定了雞抗REV血清，為建立IFA法檢測疫苗中REV奠定了基礎(chǔ)。

致謝:本試驗(yàn)得到山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授的無私支持，在此表示衷心的感謝。

［1］Saif Y M.Disease of Poultry［M］.11thedition.Ames:Ipwa Strate Press，2003.

［2］杜 巖，崔治中.禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒感染引起的雞群免疫抑制［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，21(3):122-124.

［3］孫淑紅，崔治中，邱玉玉.網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒感染SPF雞對疫苗免疫反應(yīng)的抑制作用［J］.中國病毒學(xué)，2006，21(1):34-37.

［4］宇文延清，吳延功.REV引起免疫抑制研究進(jìn)展［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，31(3):76-78.

［5］Yuasa N，Yoshida I，Taniguchi T.Isolation of a Reticuloendotheliosis Virus from Chickens Inoculated with Marek’s Disease Vaccine［J］.National Institute of Animal Health Quarterly，1976，16(4):141-151.

［6］European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia［M］.6thedition.European Directorate for the Quality of Medicines ＆ Health Care，2007.

［7］British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia(Veterinary)［M］.London:The Stationery Office，2007.

［8］農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程(二〇〇〇年版)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000.