董 浩，徐楠楠

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118;3.長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)學(xué)校，長(zhǎng)春 130102)

小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起的雛鵝的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病，傳染性強(qiáng)、病程短且死亡率高。它多發(fā)生于出殼后20日齡左右的雛鵝，其中3～5日齡雛鵝為多發(fā)日齡，發(fā)病雛鵝經(jīng)數(shù)天就波及全群，死亡率可高達(dá)70%～95%。由于該病病程短促且有較強(qiáng)的傳染、傳播、致死亡能力，目前已成為影響?zhàn)B鵝業(yè)健康發(fā)展的危害最為嚴(yán)重的傳染病，同時(shí)也給養(yǎng)殖戶和社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。感染的病鵝或番鴨可通過(guò)排出帶有大量病毒的糞便，直接或間接接觸將小鵝瘟病毒傳播給健康鵝群，從而導(dǎo)致本病迅速傳播。該病毒也可通過(guò)垂直傳播，成年鵝尤其是產(chǎn)蛋種鵝在傳播中成為隱性感染者、病毒攜帶者，它可通過(guò)鵝蛋將病毒傳播給易感的雛鵝，所以產(chǎn)蛋種鵝是重要的傳染源，也是新生雛鵝爆發(fā)小鵝瘟的重要原因。開(kāi)展GPV在產(chǎn)蛋種鵝體內(nèi)定植規(guī)律研究，可為從源頭上防控小鵝瘟提供科學(xué)依據(jù)，是深入開(kāi)展小鵝瘟感染、致病和復(fù)制機(jī)制研究的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 小鵝瘟病毒 SP株［1］、鵝副黏病毒、鵝禽流感、鵝的鴨瘟病毒均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 產(chǎn)蛋種鵝為產(chǎn)前15日齡吉林白鵝，購(gòu)于長(zhǎng)春某鵝廠。

1.1.3 主要試劑與載體 DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、dNTPs、ExTaq DNA 聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa(大連公司)。T-GPV-VP3質(zhì)粒由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室在pMD-18T載體基礎(chǔ)上構(gòu)建的帶有VP3的陽(yáng)性質(zhì)粒。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GPV SP株VP3基因序列(GenBank登陸號(hào):FJ158588)，選擇VP3保守基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)熒光定量PCR引物和Taq Man探針。引物由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成，序列如表1所示。

表1 名稱、序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè)GPV VP3基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取2 μL T-GPV-VP3質(zhì)粒，加入18 μL雙蒸餾水稀釋為原濃度的1×10-1，依次10倍梯度稀釋為1 ×10-2、1 ×10-3、1 ×10-4、1 ×10-5濃度的重組質(zhì)粒DNA。每個(gè)稀釋度設(shè)3組重復(fù)，設(shè)置一個(gè)對(duì)照組，以雙蒸餾水為模板，進(jìn)行Taq Man熒光定量檢測(cè)。PCR反應(yīng)各組分如下:Premix Ex TagTM(2 ×)12.5μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，熒光探針溶液 1 μL，模板 2 μL，補(bǔ)雙蒸水至25 μL。具體反應(yīng)條件為:95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)完畢后，啟用隨機(jī)軟件，分別錄入相應(yīng)陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)，通過(guò)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)VP3特異性試驗(yàn) 以種鵝常見(jiàn)病毒性疾病鵝副黏病毒、鵝禽流感、鵝的鴨瘟病毒為模板，應(yīng)用上述已建立的熒光定量PCR方法，檢測(cè)此方法的特異性。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)VP3靈敏性試驗(yàn) 將已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10倍梯度稀釋至3.5×102個(gè)拷貝/μL，以各梯度稀釋液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。最低起始模板濃度即為此PCR反應(yīng)的靈敏度。

1.2.5 人工感染種鵝試驗(yàn) 將購(gòu)買的產(chǎn)前15日種鵝30只(經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)為GPV陰性)隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組20只，對(duì)照組10只。試驗(yàn)組皮下注射接種GPV SP株鴨胚尿囊液，對(duì)照組接種生理鹽水，每只接種0.5 mL。從病毒感染試驗(yàn)后開(kāi)始，分別在第1、3、7、15、30 天進(jìn)行采樣，每個(gè)時(shí)間段捕殺4只試驗(yàn)組種鵝、2只對(duì)照組種鵝，采取十二指腸、空腸、盲腸、心臟、肝臟、腎臟、卵巢、輸卵管等組織臟器，十二指腸、空腸、盲腸、輸卵管取1 cm長(zhǎng)，心臟、肝臟、腎臟、卵巢取500 mg，研磨處理病料，加入PBS緩沖液，制成勻漿，反復(fù)凍融三次，分離上清液。

1.2.6 種鵝GPV定植規(guī)律研究 提取1.2.5項(xiàng)上清液中病毒DNA，按照1.2.2項(xiàng)的體系和條件進(jìn)行熒光定量PCR，繪出熒光擴(kuò)增曲線圖，根據(jù)結(jié)果分析得出各個(gè)樣品的Ct值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的起始拷貝數(shù)和樣品的病毒濃度。從而得到GPV在產(chǎn)蛋種鵝體內(nèi)的定植規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR檢測(cè)VP3標(biāo)準(zhǔn)曲線建立結(jié)果采用Taq Man實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)5個(gè)不同稀釋度擴(kuò)增時(shí)的熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)生成模板濃度擴(kuò)增反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線(圖1)。以Ct值為縱坐標(biāo)，不同標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99(R2＞0.99)，可見(jiàn)real-time PCR在稀釋度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。從而根據(jù)未知樣品的相對(duì)應(yīng)基因的Ct值，即可得出起始模板的精確拷貝數(shù)，進(jìn)而對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

圖1 T-GPV-VP3的擴(kuò)增曲線(各曲線按Ct值

圖2 GPV-VP3的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)GPV特異性試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)PCR的擴(kuò)增特性和陰性對(duì)照的熒光信號(hào)強(qiáng)度確定Ct值。Ct值小于30，確定為陽(yáng)性樣品;Ct值大于35，為陰性樣品;Ct值在30～35之間判為可疑，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)后大于30，即判為陰性。特異性熒光PCR擴(kuò)增曲線結(jié)果如圖3所示，重組質(zhì)粒Ct值小于29為陽(yáng)性，而鵝副黏病毒、禽流感病毒、鵝的鴨瘟病毒為模板DNA的Ct值均大于35為陰性，表明該檢測(cè)體系對(duì)GPV為特異性擴(kuò)增。

圖3 T-GPV-VP3的特異性擴(kuò)增曲線

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)GPV靈敏性試驗(yàn)結(jié)果當(dāng)模板濃度為3.5×103個(gè)拷貝/μL時(shí)，熒光定量PCR可以擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，因此，該P(yáng)CR方法檢測(cè)靈敏度為3.5 ×103個(gè)拷貝/μL。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)于不同濃度的模板，4個(gè)平行樣品之間的Ct值差異不顯著，表明該方法具有很好的重復(fù)性。

圖4 部分樣品的擴(kuò)增曲線

2.5 人工感染種鵝熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)試驗(yàn)組種鵝各個(gè)臟器DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線如圖4所示。根據(jù)擴(kuò)增曲線中樣品的Ct值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算出樣品的起始病毒含量(表2)。

表2 不同感染時(shí)間各部位病毒含量/2 μL組織 DNA(Lg，n=3)

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了GPV在雛鵝和雛番鴨分布規(guī)律研究，但未見(jiàn)開(kāi)展病毒在種鵝體內(nèi)定植研究。有相關(guān)報(bào)道稱，小鵝瘟病毒可垂直傳播［2-3］，小鵝瘟病毒只感染雛鵝，死亡率很高;種鵝是成年鵝，不表現(xiàn)臨床癥狀，但可攜帶病毒，并能排毒撒毒，污染周圍環(huán)境。檢測(cè)病毒的方法很多，包括免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)，免疫學(xué)的方法有一定的誤差，更精確的檢測(cè)需要進(jìn)入分子生物學(xué)的研究，熒光定量PCR是分子生物學(xué)研究中常用和可靠的方法［4-6］。熒光定量PCR的方法很多，本實(shí)驗(yàn)選擇Taq Man探針熒光定量PCR，Taq Man探針是一種核苷酸探針，探針長(zhǎng)度在15～45 bp(最好是20～30 bp)，在探針的 5’端帶有熒光物質(zhì)——FAM，3’端帶有熒光淬滅物質(zhì)——Eclipse。當(dāng)探針與靶序列相交時(shí)，F(xiàn)AM和Eclipse接近，熒光基團(tuán)被淬滅，沒(méi)有熒光信號(hào)，PCR反應(yīng)到延伸階段時(shí)，聚合酶的外切酶活性將探針切開(kāi)，F(xiàn)AM和Eclipse分開(kāi)，F(xiàn)AM重新發(fā)出熒光信號(hào)，此信號(hào)被收集。Taq Man探針?lè)ㄋ褂玫囊锖吞结樖轻槍?duì)一種核酸設(shè)計(jì)的，具有高度的特異性，并避免了普通PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能。Taq Man探針?lè)ńY(jié)果直觀、清晰，減少了普通PCR產(chǎn)物電泳觀察所帶來(lái)的危害和麻煩，同時(shí)具有穩(wěn)定性、可靠性和重復(fù)性。

通過(guò)檢測(cè)結(jié)果可以看出，人工感染成年種鵝24 h后，能夠在腸段、糞、心、肝、脾臟、腎臟、輸卵管和卵巢中檢測(cè)到病毒DNA，雖然沒(méi)有表現(xiàn)出任何臨床癥狀，GPV可以通過(guò)皮下接種的方式進(jìn)入機(jī)體，并在上述器官中增殖;在病毒感染72～168 h出現(xiàn)病毒感染的高峰期，并且在肝臟、脾臟、糞便、腸道和輸卵管中病毒含量持續(xù)較高水平，腸道中的含量最高;隨后，病毒的增殖明顯減少，病毒感染360 h后，減少最快的是在心臟和腎臟中，已經(jīng)檢測(cè)不到病毒的存在;在病毒感染720 h后，在腸道、輸卵管和卵巢中檢測(cè)不到GPV病毒DNA;在病毒感染15 d后，可在輸卵管和卵巢中檢測(cè)到微量的GPV，本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)鵝為開(kāi)產(chǎn)前15日的成年種鵝，在產(chǎn)蛋時(shí)，可能隨著卵巢和輸卵管將GPV帶到鵝蛋中，使小鵝瘟傳播。本研究為臨床更好地診斷和監(jiān)測(cè)小鵝瘟病毒提供了精密準(zhǔn)確的手段，為合理使用小鵝瘟疫苗提供了一定的理論依據(jù)。

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