劉 茜,武 松,湯林華,周水森,黃 芳,葉苗青,洪結(jié)鳳,俞俊峰

2.中國(guó)疾病控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所,世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心,上海 200025

西藏自治區(qū)的瘧疾流行歷史較為久遠(yuǎn),病例主要分布于雅魯藏布江河谷下游林芝地區(qū)的墨脫和察隅兩縣,其中以墨脫縣為主,該縣為我國(guó)瘧疾發(fā)病最高的地區(qū)之一。媒介防制為瘧疾消除非常重要的手段,使用擬除蟲菊酯類殺蟲劑進(jìn)行媒介控制是當(dāng)前媒介成蚊防制的重要措施。在殺蟲劑控制媒介的過(guò)程中應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)蚊蟲對(duì)殺蟲劑的敏感性。目前我國(guó)已有多次報(bào)道傳瘧按蚊出現(xiàn)擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性[1-6],敏感性檢測(cè)主要采用的是WHO推薦的接觸法,該方法要求必須將現(xiàn)場(chǎng)捕獲的一定數(shù)量的飽血按蚊帶回實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)卵,孵育至子一代蚊蟲方可進(jìn)行測(cè)試,對(duì)技術(shù)要求高、難于實(shí)施,尤其對(duì)交通極為不便,防瘧隊(duì)伍薄弱的墨脫縣,該法幾乎不可能實(shí)施。筆者對(duì)該縣的傳瘧媒介偽威氏按蚊的鈉離子通道蛋白基因進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序,結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲來(lái)源 按蚊成蚊采用人帳誘和誘蚊燈誘捕自墨脫縣達(dá)木鄉(xiāng)達(dá)木村(調(diào)查點(diǎn)海拔1 408m,N：29°49.627,E：95°46.227)與珠村(調(diào)查點(diǎn)海拔 1 510m,N ：29°31.120,E ：95°25.464);墨脫鎮(zhèn)墨脫村(調(diào)查點(diǎn)海拔 1178m,N ：29°19.285,E ：95°19.862);低海拔背崩鄉(xiāng)地東村(調(diào)查點(diǎn)海拔 853m,N：29°21.905,E：95°09.829)和背崩村(調(diào)查點(diǎn)海拔831m,N ：29°24.563,E：95°17.444)。 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查時(shí)間為2010年7月14日至2010年8月17日,多斑按蚊復(fù)合體具體種型通過(guò)分子方法鑒定[7]。多斑按蚊復(fù)合體5成員種鈉離子通道蛋白基因序列研究中偽威氏按蚊與威氏按蚊來(lái)自西藏墨脫縣和云南勐臘,多斑按蚊、塞沃按蚊和達(dá)羅毗按蚊基因組由第二軍醫(yī)大學(xué)馬雅軍教授惠贈(zèng)。

1.2 主要儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀(PTC-200型)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Imager HP/EP)購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech公司;電泳儀(DYY-2C型)購(gòu)自北京六一儀器廠;DNA聚合酶和脫氧核苷三磷酸(dNTPs)購(gòu)自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司;RNA酶和蛋白酶K購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.3 分子實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因提取 采用簡(jiǎn)易快速DNA提取法[8],將1～2個(gè)蚊腿置于1.5mL離心管,加入35μ L裂解液(10mmol/L pH8.0 Tirs HCl,1mmol/L EDTA,1%Nonidet P-40,100μ g/mL 蛋白酶 K),勻漿 ;再加入35μ L消毒雙蒸水,煮沸 5min;10 000r/min離心2min,取上清液置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鈉離子通道蛋白基因擴(kuò)增 采用文獻(xiàn)報(bào)道[9]的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行多斑按蚊復(fù)合體5成員種鈉離子通道蛋白基因IIS4-S6區(qū)段基因擴(kuò)增,正向引物Gen1F ：5′-GGAGARTGGATYGA RTCNATGTGGGA-3′ , 反 向 引 物 Gen1R：5′-TTNGACAAAAGCAAGGCTAAG AA-3′。PCR反應(yīng)體系為 50 μ L ：10 ×PCR 緩 沖液 ,5.0 μ L,25 mmol/L MgCl24 μ L,10 mmol/L dNTPs 1.0 μ L,正向 、反向引物各0.8 μ L(20 mmol/L),red Taq聚合酶 2.0 μ L(1 U/μ L)、DNA 模板 2.5 μ L,加水補(bǔ)至 50 μ L 。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min,94℃30 s,50℃30 s,72℃45 s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃溫育5min。

1.3.3 測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)上述擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,并成像拍照,切取目標(biāo)條帶進(jìn)行純化,采用測(cè)序試劑盒和全自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成),據(jù)測(cè)序圖驗(yàn)證PCR抗性檢測(cè)結(jié)果,多斑按蚊復(fù)合體5成員種序列比對(duì)采用Bioedit軟件完成。

2 結(jié) 果

我國(guó)多斑按蚊復(fù)合體5成員種采用簡(jiǎn)并引物全部擴(kuò)增出片段約為208bp的目標(biāo)條帶,目標(biāo)條帶測(cè)序比對(duì),獲得5成員種VGSC IIS4-S6區(qū)段基因序列信息如圖1。圖中加框所在位置為鈉離子通道蛋白基因L1014位點(diǎn),圖中可見(jiàn)多斑按蚊復(fù)合體5成員種該位點(diǎn)序列一致,均為TTA,即亮氨酸(L)。

圖1 我國(guó)多斑按蚊復(fù)合體鈉離子通道蛋白基因DII6區(qū)段基因序列信息Fig.1 Voltage-gated sodium channel DII6 segment nucleotide sequence of five members of Anopheles maculatus complex in China

對(duì)調(diào)查點(diǎn)捕獲的多斑按蚊復(fù)合體進(jìn)行分子種型鑒定后,選取墨脫縣達(dá)木鄉(xiāng)達(dá)木村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊20只)與珠村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊20只);墨脫鎮(zhèn)墨脫村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊2只);低海拔背崩鄉(xiāng)地東村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊12只)和背崩村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊7只)。共偽威氏按蚊100只,威氏按蚊61只,所有標(biāo)本測(cè)序后,均未發(fā)現(xiàn)突變,結(jié)果見(jiàn)圖2。圖中加框位置為L(zhǎng)1014位點(diǎn),所有標(biāo)本該位置測(cè)序結(jié)果顯示均未發(fā)生突變。

3 討 論

多斑按蚊復(fù)合體是馬來(lái)西亞、越南、泰國(guó)、緬甸、印度尼西亞、老撾等地的傳瘧媒介之一[10-12]。董學(xué)書[13]研究發(fā)現(xiàn)云南省偽威氏按蚊和多斑按蚊的人血指數(shù)分別為42.88%和35.71%,其密度的季節(jié)消長(zhǎng)與瘧疾流行關(guān)系密切。周紅寧[14]采用ELISA方法檢測(cè)多斑按蚊復(fù)合體中瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(CSP)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性。武松[15]等發(fā)現(xiàn)西藏瘧疾流行區(qū)墨脫縣多斑按蚊復(fù)合體包括偽威氏按蚊和威氏按蚊,并且在偽威氏按蚊唾液腺中PCR擴(kuò)增出間日瘧子孢子基因,從分子角度判定了偽威氏按蚊為墨脫縣的傳瘧媒介。同時(shí)筆者于2010年在西藏墨脫達(dá)木鄉(xiāng)研究發(fā)現(xiàn)威氏按蚊種群密度高于偽威氏按蚊,也初步具備傳瘧條件,因此筆者對(duì)西藏的這兩種按蚊的鈉離子通道蛋白基因均進(jìn)行了擴(kuò)增研究。

本次研究采用簡(jiǎn)并引物,擴(kuò)增出了我國(guó)多斑按蚊復(fù)合體5成員種的VGSC IIS4-S6區(qū)段基因,為以多斑按蚊復(fù)合體為傳瘧媒介的地區(qū)擬除蟲菊酯抗性檢測(cè)提供了基因信息,5成員種L1014位點(diǎn)均為T TA(亮氨酸)。本次共測(cè)序偽威氏按蚊和威氏按蚊161只,經(jīng)仔細(xì)核對(duì)測(cè)序圖,所有標(biāo)本L1014位點(diǎn)均未發(fā)生突變。偽威氏按蚊和威氏按蚊在墨脫縣不同海拔分布見(jiàn)差異懸殊,因此在低海拔的墨脫鎮(zhèn)和背崩鄉(xiāng)僅捕獲的威氏按蚊19只,全部進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序分析。中高海拔達(dá)木鄉(xiāng)(約1 500m),兩個(gè)自然村捕獲的偽威氏按蚊和威氏按蚊均較多,因此每村兩種按蚊各選取20只進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示墨脫縣的偽威氏按蚊和威氏按蚊擊倒抗性均尚未發(fā)生,意味著兩種按蚊對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑應(yīng)該敏感。主要因?yàn)樵摰貐^(qū)村民幾乎不使用防蚊藥品,同時(shí)按蚊滋生地稻田常年水質(zhì)流動(dòng),致使本來(lái)使用量就較少的農(nóng)藥殺蟲劑對(duì)按蚊的抗性產(chǎn)生影響較小。

圖2 偽威氏按蚊與威氏按蚊L1014位點(diǎn)測(cè)序信息圖Fig.2 Map of VGSCL1014 of An.pseudowillmori and An.willmori upper part：An.pseudowillmori;below part：An.willmori

本研究初步獲得了我國(guó)多斑按蚊復(fù)合體5成員種的鈉離子通道蛋白基因序列信息,并通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)西藏瘧疾流行區(qū)偽威氏按蚊和威氏按蚊均未發(fā)生擊倒抗性突變,為該地區(qū)在瘧疾防治中實(shí)施媒介控制方案提供了分子實(shí)驗(yàn)的依據(jù),并為該地區(qū)實(shí)施瘧疾消除過(guò)程中進(jìn)行媒介抗性監(jiān)測(cè)提供了前期的分子依據(jù),并為進(jìn)一步建立分子抗性檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)。

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