王雪蓮,欒和芝,劉 彤,趙雨杰,安春麗

2.秦皇島港口醫(yī)院檢驗(yàn)科,秦皇島 066000;

3.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室,沈陽110001;

4.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物芯片中心,沈陽 110001

肺孢子蟲(菌)肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)是由肺孢子蟲(菌)引起的一種機(jī)會(huì)感染性肺炎[1]。常見于艾滋病(AIDS)、惡性腫瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群[2-3]。最新的流行病學(xué)資料顯示：PCP的發(fā)病率在發(fā)展中國家呈明顯增長趨勢,而在美國等一些發(fā)達(dá)國家,由于普遍開展了高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)之后,PCP的發(fā)病率有所下降[4],但仍然是這些國家AIDS流行第3個(gè)十年里面臨的嚴(yán)重問題[2,5-6]。自AIDS流行以來,國內(nèi)外有許多學(xué)者一直致力于PCP防治策略以及疫苗方面的研究,但是至今尚無理想的防治措施。

肺孢子蟲55 kDa蛋白(p55)是肺孢子蟲的主要抗原成分之一,能刺激宿主產(chǎn)生抗肺孢子蟲的保護(hù)性免疫反應(yīng)[7]。Smulian等研究發(fā)現(xiàn),天然p55蛋白能刺激宿主產(chǎn)生明顯的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng),重組p55蛋白也能對肺孢子蟲感染提供保護(hù)作用[8]。Zheng等研究發(fā)現(xiàn)用 p55抗原制備的非CD4+T細(xì)胞依賴疫苗能夠預(yù)防小鼠 PCP[9]。綜上,p55是最有希望的疫苗候選抗原。由于肺孢子蟲體外培養(yǎng)困難,導(dǎo)致p55抗原來源受到限制,而多個(gè)p55蛋白變異體的存在又使得免疫效果受到了影響,這些都嚴(yán)重地阻礙了利用p55抗原進(jìn)行PCP免疫防治研究的進(jìn)展。

本研究通過生物信息學(xué)手段,預(yù)測人源p55抗原及變異體的抗原表位,選擇可能有效抗原表位,設(shè)計(jì)包含多個(gè)抗原表位的多肽,根據(jù)遺傳中心法則及大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化,將氨基酸序列轉(zhuǎn)化為核苷酸序列,人工合成該核苷酸片段,構(gòu)建原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白,并對此表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。研究結(jié)果不僅解決p55來源困難和p55單價(jià)抗原免疫范圍小的難題,為PCP疫苗的研究奠定基礎(chǔ),而且還為PCP的免疫學(xué)診斷提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)DH5α購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,質(zhì)粒載體pGEX-6p-1(含GST標(biāo)簽)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamH I和NotI購自大連寶生物工程有限公司,質(zhì)粒DNA提取試劑盒,DNA標(biāo)記物、蛋白標(biāo)記物、蛋白上樣緩沖液、異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、蛋白胨、酵母粉、購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,Anti-GST-Ab,H RP標(biāo)記羊抗兔IgG,PVDF膜購自大連寶生物工程有限公司。其他常規(guī)試劑購自沈陽化學(xué)試劑采購供應(yīng)站。

1.1.3 數(shù)據(jù)庫和預(yù)測軟件 采用http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST提供的BLAST軟件、網(wǎng)絡(luò)共享軟件Antigenic Peptide Prediction以及 Laser gene DNASTAR軟件,進(jìn)行蛋白質(zhì)序列及性質(zhì)分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗原表位預(yù)測 自NCBI網(wǎng)站的蛋白數(shù)據(jù)庫中獲取p55抗原及4個(gè)變異體信息(登記號(hào)分別為 AAQ06669、AAQ06670、AAX14020、AAQ06672、AAQ06673)。利用哈佛大學(xué)提供的網(wǎng)絡(luò)共享Antigenic Peptide Prediction 軟件(http ：//bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl)及 Lasergene DNASTAR軟件,分析p55抗原及變異體的結(jié)構(gòu),預(yù)測可能的抗原表位。綜合預(yù)測結(jié)果,設(shè)計(jì)抗原表位肽串聯(lián)多肽。根據(jù)遺傳中心法則及大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化,將氨基酸序列轉(zhuǎn)化為核苷酸序列,即編碼多個(gè)抗原表位的嵌合基因。

1.2.2 嵌合基因的合成和測序鑒定 嵌合基因全長1 180 bp,在基因片段上下游分別引入BamH I和NotI酶切位點(diǎn)(圖 1中粗體部分),命名為CAG,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并測序驗(yàn)證。

1.2.3 pGEX-6p-1/CAG原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將CAG基因連接在原核表達(dá)載體pGEX-6p-1上,插入位點(diǎn)為BamH I和NotI,與標(biāo)簽GST連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CAG,并將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌E.coliDH5α。用含重組質(zhì)粒的E.coli涂布于含有氨芐青霉素(Amp,100μ g/mL)的LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%NaCl),于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取孤立菌落接種于2 mL LB培養(yǎng)基(Amp,100μ g/mL)中,37℃培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒,限制性內(nèi)切酶BamH I和NotI酶切,測序鑒定。

1.2.4 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將上述過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100的比例接種到含300 mL LB液體培養(yǎng)基(Amp,100μ g/mL)中,37℃振蕩培養(yǎng)至菌液吸光度(A550)為0.8～1.0時(shí),IPTG(1 mmol/L)37℃誘導(dǎo)表達(dá)。4℃12 000×g離心10min,蛋白裂解液重懸沉淀。分別用 1、2、4、6 mol/L尿素充分振蕩、洗滌,4℃12 000×g離心15min,重復(fù)上述步驟一次。沉淀重懸于含8 mol/L尿素的包涵體溶解緩沖液中,充分溶解包涵體后,4℃12 000g離心 15min,收集上清,沉淀用 PBS重懸。取不同濃度尿素洗滌純化的上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析融合蛋白存在形式。

1.2.5 Western Blotting分析表達(dá)產(chǎn)物 分別取IPTG誘導(dǎo)后0 h、2 h、4 h和6 h菌液1 mL,10 000×g離心15min,將沉淀重懸于50 μ L蛋白裂解液中,液氮 3 min,37℃水浴3 min,重復(fù) 3次,超聲裂解后加等體積的2×SDS載樣緩沖液,100℃變性5 min,8%SDS-PAGE蛋白電泳,轉(zhuǎn)印PVDF膜。洗膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h。加入Anti-GST-Ab抗體(1∶500稀釋),4℃孵育過夜。PBS洗膜4次,再加入羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋),室溫孵育2 h,DAB顯色。

2 結(jié) 果

2.1 包含多個(gè)p55抗原表位的多肽選擇 根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫中獲取的p55抗原氨基酸序列,利用軟件對p55蛋白抗原性相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行預(yù)測分析,從已報(bào)道的p55抗原及4個(gè)變異體中選擇可能有效的抗原表位,各表位串聯(lián)后進(jìn)一步分析,各表位相對獨(dú)立,具有較高的抗原性參數(shù)指標(biāo)。此多肽的氨基酸序列為：Mgfhkamlicaiigvtlgvwhrkgfqemlicaiigmtl gvwiekmgslfiifaviarvffktdhecnnlkehckdilaesckkvqg kcldlglltpmelpselkesvhivikryqndtedqclitetvtvtavpek tletedqcsitetvtvtvtpek eslcsitetvtvtfsrdsrslciksiscds iskylkemdftkkdcvdlaaevcsfakenftkthtlltistvtvtemaq ftkthtilsvstvlvtelapethftkthtvltvstvvvtetaqmaqdiyt hikiliktktcclgrptketaqythtyirtliktenivkraflaglkpdfg kgvrvegfhkagkgvrverfhkagkgvrvegfqkefesgsyyqp mdlas。

2.2 嵌合基因序列 我們選擇了大腸桿菌偏好的密碼子,以提高短肽串聯(lián)基因在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)效率,將上述氨基酸序列轉(zhuǎn)化為核苷酸序列(圖1),在基因的上下游分別加入BamH I和NotI酶切位點(diǎn)(粗體部分)。

圖1 嵌合基因序列圖Fig.1 The sequence of the chimeric antigen gene

2.3 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CAG的鑒定

2.3.1 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CAG的雙酶切鑒定

pGEX-6p-1載體片斷長度約4 900bp,CAG基因片段長度為1 180bp。重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CAG經(jīng)BamHI和NotI雙酶切的電泳結(jié)果出現(xiàn)了約4,900 bp及 1 180 bp的特異性條帶(圖 2),表明pGEX-6p-1/CAG表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CAG的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEX-6p-1/CAG by Restriction enzyme digestion

2.3.2 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CAG的測序結(jié)果重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/CAG由上海生工生物工程有限公司作序列測定,結(jié)果證實(shí)了其堿基序列及讀碼框架與設(shè)計(jì)完全相符(圖3)。

2.4 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western Blotting鑒定結(jié)果 攜帶質(zhì)粒 pGEX-6p-1/CAG和pGEX-6p-1的E.coli表分別達(dá)出分子量約69 000的GST-CAG融合蛋白和26 000 GST蛋白。SDSPAGE電泳結(jié)果顯示,誘導(dǎo)的pGEX-6p-1/CAG菌體蛋白在相對分子質(zhì)量(Mr)69 000處有GST融合蛋白條帶(圖4),與生物信息學(xué)分析預(yù)測的分子量相符。各濃度尿素洗滌后的沉淀及上清中在Mr69 000處可見目的條帶,沉淀中目的條帶均較上清明顯(圖4),結(jié)果表明此重組融合蛋白是以包涵體及溶解2種形式存在,但主要以包涵體形式存在。4mol/L尿素洗滌包涵體效果較好(圖4)。

Western Blotting結(jié)果顯示此融合蛋白能被Anti-GST-Ab識(shí)別,在Mr69 000處形成特異性反應(yīng)條帶(見圖5)。IPTG誘導(dǎo)4h后融合蛋白表達(dá)量大(圖5)。結(jié)果表明嵌合基因CAG在原核細(xì)胞中得到了有效的表達(dá)。

3 討 論

資料表明,PCP是艾滋病患者最常見的并發(fā)癥,有超過90%的AIDS患者是因PCP而確診,因而被視為AIDS的“標(biāo)志性疾病”[2]。臨床資料顯示：PCP一旦發(fā)生,病情進(jìn)展迅速,若不及時(shí)治療,病死率高達(dá)100%。迄今既沒有理想的治療藥物,也無有效的疫苗問世。因此,開發(fā)有效的防治PCP等機(jī)會(huì)感染性疾病的新策略對HIV感染者以及其他免疫機(jī)能低下人群的健康和生存質(zhì)量都具有深遠(yuǎn)影響。

圖3 pGEX-6p-1/CAG質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.3 The result of plasmid pGEX-6p-1/CAG sequencing

圖4 pGEX-6p-1/CAG表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析1-8為不同濃度(1 mol/L,2 mol/L,4 mol/L,6 mol/L)尿素洗滌的重組蛋白CAG-GST的上清與沉淀。9為蛋白質(zhì)標(biāo)記物Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression products of pGEX-6p-1/CAG1-8 Supernatant and precipitation containing recombinant protein CAG-GST washed by different urea concentrations(1 mol/L,2 mol/L,4 mol/L,6mol/L).9 protein M arker

圖5 免疫印跡法對重組蛋白的鑒定1為蛋白標(biāo)記物;2-6為IPTG誘導(dǎo)(0～4h)的重組蛋白Fig.5 Identification of recombinant protein by Western Blot 1 protein marker;2-6 induced(0-4h)recombinant protein

p55抗原是最有希望的疫苗候選抗原,在預(yù)防PCP的疫苗研究中比肺孢子菌的主要表面糖蛋白(MSG,gpA)更受青睞。由于p55抗原來源困難及存在變異體和致病因子等問題限制了以p55蛋白為抗原的疫苗研制。本研究以多個(gè)抗原表位為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)基因工程疫苗,選擇p55抗原作為目的蛋白,最大限度的刪除致病因子,保留可有效誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的成分。將p55抗原及4種變異體抗原表位進(jìn)行串聯(lián)后,各表位仍相對獨(dú)立,具有較高的抗原性參數(shù)指標(biāo)。因此,表達(dá)出的重組CAG蛋白應(yīng)該具備更好的抗原性,且可實(shí)現(xiàn)單價(jià)疫苗多價(jià)免疫的效果。

本實(shí)驗(yàn)是通過生物信息學(xué)技術(shù),網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫結(jié)合生物軟件分析的方法預(yù)測p55蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),親水性,穿膜螺旋,N-糖基化位點(diǎn),氨基酸序列的親疏水性,表面可及性,分子柔韌性及抗原性指數(shù)等,確定可能在肺孢子蟲感染過程中起重要作用的并具有較好抗原性參數(shù)的結(jié)構(gòu)區(qū)域作為抗原表位。從5個(gè)p55蛋白變異體中選取了十二個(gè)B細(xì)胞表位,這十二段短肽通過軟件預(yù)測沒有穿膜螺旋和N-糖基化位點(diǎn),具有很好的親水性和可及性,進(jìn)入宿主體內(nèi)應(yīng)處于伸展?fàn)顟B(tài),易于接近宿主細(xì)胞受體。短肽的這些特性使其適用于基因工程疫苗的進(jìn)一步研制。通過密碼子優(yōu)化和不同的線性排列組合篩選,選取了具有最好抗原性參數(shù)的排列,根據(jù)遺傳中心法則轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账嵝蛄?。?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多表位嵌合基因片段在接入pGEX-6p-1原核表達(dá)載體后能夠有效表達(dá)出預(yù)期大小的蛋白片段。將多表位嵌合基因應(yīng)用于疫苗研制從理論上比單表位短肽疫苗具有更好的免疫原性以及更好的抗蛋白變異體的能力。但是實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)CAG-GST融合蛋白的表達(dá)率低、包涵體復(fù)性率低以及純化費(fèi)用較高,這些問題尚需進(jìn)一步研究解決。重組融合蛋白的抗原性以及其預(yù)防感染的效果還需要進(jìn)一步的研究及驗(yàn)證。

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