劉永輝 周佳萍 孫小沛③ 楊在賓(山東省大發(fā)飼料有限公司 濟(jì)南 250306 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 北京 ③ 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安)

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NSP酶對(duì)植酸酶降解植酸效率影響的報(bào)告

劉永輝①周佳萍②孫小沛③ 楊在賓③*(①山東省大發(fā)飼料有限公司 濟(jì)南 250306 ②中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 北京 ③ 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安)

本試驗(yàn)旨在研究NSP酶對(duì)植酸酶降解植酸效率的影響。試驗(yàn)以肉雞常用豆粕為研究材料，設(shè)6個(gè)處理，試驗(yàn)I為對(duì)照組，不添加任何酶制劑，試驗(yàn)II組添加0.5FTU/g植酸酶，試驗(yàn)III、IV、V、VI組分別在試驗(yàn)II日糧基礎(chǔ)上添加纖維素酶20U、果膠酶20U、木聚糖酶20U、復(fù)合酶(7U纖維素酶+7U果膠酶+7U木聚糖酶)，比較不同處理植酸磷的釋放量。結(jié)果表明：與不添加任何酶比較，添加植酸酶、植酸酶+纖維素酶、植酸酶＋果膠酶、植酸酶＋木聚糖酶、植酸酶＋纖維素復(fù)合酶對(duì)豆粕中植酸磷的降解率分別提高了36.98%、37.06%、37.67%、38.20%和38.28%。與僅添加植酸酶比較，植酸酶+纖維素酶、植酸酶＋果膠酶、植酸酶＋木聚糖酶、植酸酶＋纖維素復(fù)合酶對(duì)豆粕中植酸磷的降解率分別提高了0.10%、0.87%、1.55%、1.64%。此結(jié)果說(shuō)明，NSP酶能夠提高植酸酶降解植酸的效率。

NSP酶 植酸酶 植酸降解率

飼料原料中植酸和非淀粉多糖(NSP)的存在，大大降低了養(yǎng)分的消化率，進(jìn)而影響畜禽的生產(chǎn)性能。大多數(shù)植物籽實(shí)及谷物中60%~80%的磷以植酸磷的形式存在(NRC，1994)，動(dòng)物很難將這部分磷降解，添加植酸酶能提高飼料磷的利用率，降低飼料添加無(wú)機(jī)磷的成本，減少磷的排出量。NSP酶具有降解植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放，降低食糜黏度，提高內(nèi)源消化酶活性，降低畜禽腸道發(fā)病率等作用[1]。目前，關(guān)于酶制劑在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用研究，主要集中在對(duì)植酸酶或NSP酶的單獨(dú)添加，有關(guān)2種酶同時(shí)添加的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)以常用的蛋白質(zhì)飼料——豆粕為研究材料，研究NSP酶(纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶及纖維素復(fù)合酶)對(duì)植酸酶降解植酸效率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器 植酸酶：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)承擔(dān)的國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：“利用定點(diǎn)突變技術(shù)研究二硫鍵等對(duì)植酸酶結(jié)構(gòu)、催化活性及熱穩(wěn)定性的作用”的攻關(guān)成果，本課題組已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，這種植酸酶發(fā)酵液活力達(dá)242FTU/ml，表達(dá)植酸酶的比活力為503FTU/mg蛋白。纖維素酶：10萬(wàn)U/g；果膠酶：5萬(wàn)U/g；木聚糖酶：20萬(wàn)U/g；纖維素復(fù)合酶：由纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶組成。均由華芬飼料酶有限公司提供。

醋酸-醋酸鈉緩沖液，2M植酸鈉溶液，10%鉬酸銨，硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，10% TCA。

Ultrospec 4300 pro UV-Visible 分光光度計(jì)；D-37529 Osterode高速冷凍離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)分組 以豆粕為試驗(yàn)材料，對(duì)照組不添加任何酶制劑，試驗(yàn)II組添加0.5FTU/g植酸酶，試驗(yàn)III、IV、V、VI組在添加0.50FTU/g植酸酶基礎(chǔ)上分別添加纖維素酶20U、果膠酶20U、木聚糖酶20U、復(fù)合酶(7U纖維素酶+7U果膠酶+7U木聚糖酶)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及分析 （1）豆粕植酸含量的測(cè)定。本試驗(yàn)豆粕中植酸含量的變化是通過(guò)測(cè)定植酸釋放出來(lái)的磷含量的變化來(lái)表示。取1.5g可通過(guò)60目篩的豆粕，在碘量瓶中用15ml 0.1 M HAc-NaAc緩沖液(pH5.5)混合。每克豆粕添加酶水平分別是0FTU，0.5FTU植酸酶，0.5FTU植酸酶+20U纖維素酶，0.5FTU植酸酶+20U果膠酶，0.5FTU植酸酶+20U木聚糖酶，0.5FTU植酸酶+復(fù)合酶?；旌弦涸?7℃培養(yǎng)3h，并且以200rpm/min晃動(dòng)，再把樣品立即放入冰中終止反應(yīng)。樣品在4℃，800×g離心15min。取上清1ml加4ml 12.5%TCA放置15min，然后在4℃，350×g離心15min。取上清1000μl加顯色劑1000μl在37℃培養(yǎng)5min，在660nm波長(zhǎng)處比色。以不添加植酸酶的對(duì)照組作為空白進(jìn)行比色。（2）定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。0.1M KH2PO4母液：準(zhǔn)確稱取1.36gKH2PO4，加水溶解，在容量瓶中定容至100ml，備用；1000nmol/ml KH2PO4：將0.1M KH2PO4母液稀釋100倍。

按下表配置成含有不同磷濃度的溶液(總體積1000μl)：

1000nmol/ml KH2PO4母液體積(μl)0100200300400500 0.1M HAc-NaAc緩沖液(pH 5.5)體積(μl)1000900800700600500 最終磷濃度(nmol/ml)0100200300400500

將不同磷濃度的溶液1000μl(對(duì)照取500μl 0.1M HAc-NaAc緩沖液)與1000μl硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液混合，37℃溫育5min，顯色后用分光光度計(jì)測(cè)定660nm處的吸光值。以吸光值為橫坐標(biāo)，反應(yīng)體系中磷的濃度為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=1235.8X，R2=0.9997 [Y：無(wú)機(jī)磷含量(nmol/ml)，X：吸光度(660nm)]

2 結(jié)果

在0.5FTU/g植酸酶基礎(chǔ)上添加纖維素酶20U、果膠酶20U、木聚糖酶20U、復(fù)合酶(7U纖維素酶+7U果膠酶+7U木聚糖酶)，釋放豆粕中的植酸磷的比較見(jiàn)圖2。從圖中可以看出，植酸酶加纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶或纖維素復(fù)合酶共同作用，對(duì)豆粕中植酸磷的降解效果要優(yōu)于植酸酶單獨(dú)使用。與不添加任何酶比較，添加植酸酶、植酸酶+纖維素酶、植酸酶＋果膠酶、植酸酶＋木聚糖酶、植酸酶＋纖維素復(fù)合酶對(duì)豆粕中植酸磷的降解率分別提高了36.98%，37.06%，37.67%，38.20%和38.28%。與僅添加植酸酶比較，植酸酶+纖維素酶、植酸酶＋果膠酶、植酸酶＋木聚糖酶、植酸酶＋纖維素復(fù)合酶對(duì)豆粕中植酸磷的降解率分別提高了0.10%，0.87%，1.55%，1.64%。

圖2 NSP酶對(duì)植酸酶降解植酸效率的影響

*CON：無(wú)酶；PHY：植酸酶；PHY-CELE：植酸酶+纖維素酶； PHY-PE：植酸酶+果膠酶；PHY-XE：植酸酶+木聚糖酶；PHY-CE：植酸酶+復(fù)合酶

3 討論

劉志偉等在體外條件下研究溫度、pH、纖維素酶和果膠酶對(duì)外源植酸酶作用效果的影響，研究證明添加纖維素酶和果膠酶能有效促進(jìn)植酸酶的降解作用，提高植酸降解率[2]。陳乃松等研究發(fā)現(xiàn)用植酸酶、果膠酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶制劑處理豆粕，豆粕中果膠、纖維素的含量與這兩種單一酶處理相比有顯著的差異(P<0.05)，植酸的含量較單一植酸酶處理相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。但用植酸酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶和SB酶(含α-半乳糖苷酶和木聚糖酶)組成的復(fù)合酶處理豆粕，果膠、纖維素和植酸與單一酶添加組相比均呈現(xiàn)出顯著的差異(P<0.05)，說(shuō)明多酶復(fù)合的使用有助于去除豆粕中的相關(guān)抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]。

本試驗(yàn)證明，在適宜的體外條件下，植酸酶基礎(chǔ)上添加NSP酶能夠提高植酸降解效率。這與前人研究結(jié)果基本一致。分析結(jié)果原因可能是，植酸鹽主要分布在糊粉層，NSP酶通過(guò)降解細(xì)胞壁基質(zhì)增強(qiáng)了植酸酶與其底物植酸鹽的接觸，有利于植酸酶作用于植酸鹽。

4 結(jié)論

NSP酶能夠提高植酸酶降解植酸的效率，本試驗(yàn)復(fù)合NSP酶的添加使植酸酶對(duì)植酸的降解率提高了1.64%，效果最為顯著。

[1] 吳建忠, 李綠雄. 木聚糖酶在畜禽營(yíng)養(yǎng)中的研究及應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù). 2005，25(2):74~77.

[2] 劉志偉, 陳華杏, 張晨. 外源酶對(duì)糙米中植酸降解的影響[J]. 食品科學(xué). 2010, 31(5):215~218.

[3] 陳乃松, 楊志剛, 崔惟東等. 酶制劑體外酶解豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究[J]. 大豆科學(xué).2008, 27(4):664~668.

（2011–04–20）

利用定點(diǎn)突變技術(shù)研究二硫鍵等對(duì)植酸酶結(jié)構(gòu)、催化活性及熱穩(wěn)定性的作用，編號(hào)30471261

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