劉永輝 周佳萍 孫小沛③ 楊在賓(山東省大發(fā)飼料有限公司 濟(jì)南 250306 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 北京 ③ 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安)

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NSP酶對(duì)植酸酶降解植酸效率影響的報(bào)告

劉永輝①周佳萍②孫小沛③ 楊在賓③*(①山東省大發(fā)飼料有限公司 濟(jì)南 250306 ②中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 北京 ③ 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安)

本試驗(yàn)旨在研究NSP酶對(duì)植酸酶降解植酸效率的影響。試驗(yàn)以肉雞常用豆粕為研究材料，設(shè)6個(gè)處理，試驗(yàn)I為對(duì)照組，不添加任何酶制劑，試驗(yàn)II組添加0.5FTU/g植酸酶，試驗(yàn)III、IV、V、VI組分別在試驗(yàn)II日糧基礎(chǔ)上添加纖維素酶20U、果膠酶20U、木聚糖酶20U、復(fù)合酶(7U纖維素酶+7U果膠酶+7U木聚糖酶)，比較不同處理植酸磷的釋放量。結(jié)果表明：與不添加任何酶比較，添加植酸酶、植酸酶+纖維素酶、植酸酶＋果膠酶、植酸酶＋木聚糖酶、植酸酶＋纖維素復(fù)合酶對(duì)豆粕中植酸磷的降解率分別提高了36.98%、37.06%、37.67%、38.20%和38.28%。與僅添加植酸酶比較，植酸酶+纖維素酶、植酸酶＋果膠酶、植酸酶＋木聚糖酶、植酸酶＋纖維素復(fù)合酶對(duì)豆粕中植酸磷的降解率分別提高了0.10%、0.87%、1.55%、1.64%。此結(jié)果說明，NSP酶能夠提高植酸酶降解植酸的效率。

NSP酶 植酸酶 植酸降解率

飼料原料中植酸和非淀粉多糖(NSP)的存在，大大降低了養(yǎng)分的消化率，進(jìn)而影響畜禽的生產(chǎn)性能。大多數(shù)植物籽實(shí)及谷物中60%~80%的磷以植酸磷的形式存在(NRC，1994)，動(dòng)物很難將這部分磷降解，添加植酸酶能提高飼料磷的利用率，降低飼料添加無機(jī)磷的成本，減少磷的排出量。NSP酶具有降解植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)釋放，降低食糜黏度，提高內(nèi)源消化酶活性，降低畜禽腸道發(fā)病率等作用[1]。目前，關(guān)于酶制劑在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用研究，主要集中在對(duì)植酸酶或NSP酶的單獨(dú)添加，有關(guān)2種酶同時(shí)添加的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)以常用的蛋白質(zhì)飼料——豆粕為研究材料，研究NSP酶(纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶及纖維素復(fù)合酶)對(duì)植酸酶降解植酸效率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器 植酸酶：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)承擔(dān)的國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：“利用定點(diǎn)突變技術(shù)研究二硫鍵等對(duì)植酸酶結(jié)構(gòu)、催化活性及熱穩(wěn)定性的作用”的攻關(guān)成果，本課題組已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，這種植酸酶發(fā)酵液活力達(dá)242FTU/ml，表達(dá)植酸酶的比活力為503FTU/mg蛋白。纖維素酶：10萬U/g；果膠酶：5萬U/g；木聚糖酶：20萬U/g；纖維素復(fù)合酶：由纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶組成。均由華芬飼料酶有限公司提供。

醋酸-醋酸鈉緩沖液，2M植酸鈉溶液，10%鉬酸銨，硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，10% TCA。

Ultrospec 4300 pro UV-Visible 分光光度計(jì)；D-37529 Osterode高速冷凍離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)分組 以豆粕為試驗(yàn)材料，對(duì)照組不添加任何酶制劑，試驗(yàn)II組添加0.5FTU/g植酸酶，試驗(yàn)III、IV、V、VI組在添加0.50FTU/g植酸酶基礎(chǔ)上分別添加纖維素酶20U、果膠酶20U、木聚糖酶20U、復(fù)合酶(7U纖維素酶+7U果膠酶+7U木聚糖酶)。

1.3 指標(biāo)測定及分析 （1）豆粕植酸含量的測定。本試驗(yàn)豆粕中植酸含量的變化是通過測定植酸釋放出來的磷含量的變化來表示。取1.5g可通過60目篩的豆粕，在碘量瓶中用15ml 0.1 M HAc-NaAc緩沖液(pH5.5)混合。每克豆粕添加酶水平分別是0FTU，0.5FTU植酸酶，0.5FTU植酸酶+20U纖維素酶，0.5FTU植酸酶+20U果膠酶，0.5FTU植酸酶+20U木聚糖酶，0.5FTU植酸酶+復(fù)合酶?；旌弦涸?7℃培養(yǎng)3h，并且以200rpm/min晃動(dòng)，再把樣品立即放入冰中終止反應(yīng)。樣品在4℃，800×g離心15min。取上清1ml加4ml 12.5%TCA放置15min，然后在4℃，350×g離心15min。取上清1000μl加顯色劑1000μl在37℃培養(yǎng)5min，在660nm波長處比色。以不添加植酸酶的對(duì)照組作為空白進(jìn)行比色。（2）定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。0.1M KH2PO4母液：準(zhǔn)確稱取1.36gKH2PO4，加水溶解，在容量瓶中定容至100ml，備用；1000nmol/ml KH2PO4：將0.1M KH2PO4母液稀釋100倍。

按下表配置成含有不同磷濃度的溶液(總體積1000μl)：

1000nmol/ml KH2PO4母液體積(μl)0100200300400500 0.1M HAc-NaAc緩沖液(pH 5.5)體積(μl)1000900800700600500 最終磷濃度(nmol/ml)0100200300400500

將不同磷濃度的溶液1000μl(對(duì)照取500μl 0.1M HAc-NaAc緩沖液)與1000μl硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液混合，37℃溫育5min，顯色后用分光光度計(jì)測定660nm處的吸光值。以吸光值為橫坐標(biāo)，反應(yīng)體系中磷的濃度為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=1235.8X，R2=0.9997 [Y：無機(jī)磷含量(nmol/ml)，X：吸光度(660nm)]

2 結(jié)果

在0.5FTU/g植酸酶基礎(chǔ)上添加纖維素酶20U、果膠酶20U、木聚糖酶20U、復(fù)合酶(7U纖維素酶+7U果膠酶+7U木聚糖酶)，釋放豆粕中的植酸磷的比較見圖2。從圖中可以看出，植酸酶加纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶或纖維素復(fù)合酶共同作用，對(duì)豆粕中植酸磷的降解效果要優(yōu)于植酸酶單獨(dú)使用。與不添加任何酶比較，添加植酸酶、植酸酶+纖維素酶、植酸酶＋果膠酶、植酸酶＋木聚糖酶、植酸酶＋纖維素復(fù)合酶對(duì)豆粕中植酸磷的降解率分別提高了36.98%，37.06%，37.67%，38.20%和38.28%。與僅添加植酸酶比較，植酸酶+纖維素酶、植酸酶＋果膠酶、植酸酶＋木聚糖酶、植酸酶＋纖維素復(fù)合酶對(duì)豆粕中植酸磷的降解率分別提高了0.10%，0.87%，1.55%，1.64%。

圖2 NSP酶對(duì)植酸酶降解植酸效率的影響

*CON：無酶；PHY：植酸酶；PHY-CELE：植酸酶+纖維素酶； PHY-PE：植酸酶+果膠酶；PHY-XE：植酸酶+木聚糖酶；PHY-CE：植酸酶+復(fù)合酶

3 討論

劉志偉等在體外條件下研究溫度、pH、纖維素酶和果膠酶對(duì)外源植酸酶作用效果的影響，研究證明添加纖維素酶和果膠酶能有效促進(jìn)植酸酶的降解作用，提高植酸降解率[2]。陳乃松等研究發(fā)現(xiàn)用植酸酶、果膠酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶制劑處理豆粕，豆粕中果膠、纖維素的含量與這兩種單一酶處理相比有顯著的差異(P<0.05)，植酸的含量較單一植酸酶處理相比無顯著差異(P>0.05)。但用植酸酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶和SB酶(含α-半乳糖苷酶和木聚糖酶)組成的復(fù)合酶處理豆粕，果膠、纖維素和植酸與單一酶添加組相比均呈現(xiàn)出顯著的差異(P<0.05)，說明多酶復(fù)合的使用有助于去除豆粕中的相關(guān)抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]。

本試驗(yàn)證明，在適宜的體外條件下，植酸酶基礎(chǔ)上添加NSP酶能夠提高植酸降解效率。這與前人研究結(jié)果基本一致。分析結(jié)果原因可能是，植酸鹽主要分布在糊粉層，NSP酶通過降解細(xì)胞壁基質(zhì)增強(qiáng)了植酸酶與其底物植酸鹽的接觸，有利于植酸酶作用于植酸鹽。

4 結(jié)論

NSP酶能夠提高植酸酶降解植酸的效率，本試驗(yàn)復(fù)合NSP酶的添加使植酸酶對(duì)植酸的降解率提高了1.64%，效果最為顯著。

[1] 吳建忠, 李綠雄. 木聚糖酶在畜禽營養(yǎng)中的研究及應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù). 2005，25(2):74~77.

[2] 劉志偉, 陳華杏, 張晨. 外源酶對(duì)糙米中植酸降解的影響[J]. 食品科學(xué). 2010, 31(5):215~218.

[3] 陳乃松, 楊志剛, 崔惟東等. 酶制劑體外酶解豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究[J]. 大豆科學(xué).2008, 27(4):664~668.

（2011–04–20）

利用定點(diǎn)突變技術(shù)研究二硫鍵等對(duì)植酸酶結(jié)構(gòu)、催化活性及熱穩(wěn)定性的作用，編號(hào)30471261

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