任 聰，孟憲生，包永瑞

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600

體外篩選川芎治療冠心病的有效成分的提取純化工藝研究

任 聰，孟憲生，包永瑞

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600

目的：通過(guò)體外篩選方法，優(yōu)選川芎治療冠心病的有效成分的提取純化工藝。方法：培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞，利用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）缺氧1 h復(fù)氧1 h，損傷心肌細(xì)胞制備心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷模型來(lái)模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷，通過(guò)體外篩選方法，優(yōu)選出川芎治療冠心病的有效成分的最佳提取和純化工藝。結(jié)果：優(yōu)選出川芎的最佳提取工藝為使用6倍量的水，提取2次，每次1 h；其純化工藝為使用15 ml HPD-300樹脂，取9 BV的0.5 g/ml的川芎提取液上樣，以5 BV的50%醇洗脫。結(jié)論：通過(guò)體外篩選的提取純化工藝可信度高，為開(kāi)發(fā)研究心腦血管疾病的藥物提供了依據(jù)。

川芎；提??；純化；原代乳鼠心肌細(xì)胞；冠心?。贿B二亞硫酸鈉

川芎是一種廣泛應(yīng)用于臨床來(lái)治療冠心病的常用中藥，現(xiàn)代研究表明川芎具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴(kuò)血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用，本文通過(guò)原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)，利用連二亞硫酸鈉損傷心肌細(xì)胞來(lái)模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷，篩選出川芎治療冠心病的有效成分及其最佳提取和純化工藝。

1 儀器與試藥

1.1 藥品和試劑

川芎（購(gòu)于安國(guó)藥材批發(fā)市場(chǎng)），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為正品；四甲基偶氮唑酶（美國(guó)Difco公司）；膠原酶Ⅰ （美國(guó)GIBCO公司）；DMEM高糖和低糖培養(yǎng)液 （美國(guó)GIBCO公司出品）；連二亞硫酸鈉（天津市化學(xué)試劑三廠）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 動(dòng)物

新生SD乳鼠（1～3 d），由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室中心提供，達(dá)到國(guó)家清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 主要儀器

NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)NUAIRE公司）；AE31型倒置熒光相差顯微鏡 （Motic公司）；UNRISE酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎提取條件的考察[1-5]

2.1.1 提取溶劑的考察取川芎藥材5份，每份25 g，分別加入6倍量的水、30%醇、50%醇、70%醇、90%醇提取，提取1 h，離心，濃縮，定容至50 ml，保存，備用。

2.1.2 正交試驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選擇溶媒量、提取時(shí)間、提取次數(shù)三個(gè)因素，對(duì)主要影響因素各取三個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)考察，優(yōu)選最佳提取條件。見(jiàn)表1。

表1 川芎提取條件的因素和水平表

2.2 川芎純化條件的考察[5-7]

2.2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)取強(qiáng)極性、中極性、弱極性、非極性的HPD-300、HPD-400、NKA-9、AB-8 四種樹脂各 1 g，置于 50 ml的錐形瓶中，加入30 ml川芎提取液，每隔20 min振搖10 s，靜置24 h，次日過(guò)濾，保留樹脂，將濾液定容至50 ml容量瓶中，保存，備用。

2.2.2 靜態(tài)解析試驗(yàn)將過(guò)濾后的樹脂轉(zhuǎn)移至50 ml的錐形瓶中，加入30 ml 95%醇，不斷振搖，過(guò)濾至50 ml容量瓶中，保存，備用。

2.3 泄露曲線[5-7]

取HPD-300樹脂10 ml上樹脂柱，先用95%醇洗，再用大量的水洗至沒(méi)有醇味，加入0.5 g/ml的川芎提取液，每10 ml接一管，收集洗脫液。床層體積為1、2、3……12 BV。

2.4 動(dòng)態(tài)洗脫[5-7]

2.4.1 洗脫溶媒的考察取HPD-300樹脂10 ml上樹脂柱，依次用3 BV的水、30%醇、50%醇、70%醇、90%醇洗脫，分別定容至50 ml容量瓶里，保存，備用。

2.4.2 洗脫劑用量的考察取HPD-300樹脂10 ml上樹脂柱，先用95%醇洗，再用大量的水洗至沒(méi)有醇味，加入90 ml川芎提取液，用30%乙醇洗脫，每10 ml接一管，收集洗脫液，備用。 床層體積為 1、2、3……8 BV。

2.5 原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

2.5.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)[8-10]取新生SD乳鼠若干只，無(wú)菌條件下開(kāi)胸取心，用PBS液洗凈殘血。將心室剪成1 mm×1 mm×1 mm碎塊，放入培養(yǎng)皿里，加入適量冷PBS，用胰蛋白酶與膠原酶Ⅰ的混合消化液，置37℃水浴中多次消化，收集細(xì)胞懸液，以差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，將心肌細(xì)胞懸液靜置在培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)60 min，心肌成纖維細(xì)胞很快貼壁，吸出細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105～10×105個(gè)/ml，轉(zhuǎn)接于96孔板里培養(yǎng)，獲得較純的心肌細(xì)胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，選生長(zhǎng)狀態(tài)佳者于72 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型的制備取已經(jīng)接種的96孔板，隨機(jī)分成2組：①缺氧復(fù)氧損傷組：加入400 μmol連二亞硫酸鈉缺氧1 h，復(fù)氧1 h；②給藥組：加入各組的溶液。各組均在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h。

2.5.3 細(xì)胞活力的測(cè)定采用MTT法，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以105個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)72 h后用于實(shí)驗(yàn)，缺氧復(fù)氧后每孔加入 20 μl（5 mg/ml）MTT 試劑，37℃、5%的 CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育 4 h，棄上清，加入 150 μl二甲基亞砜（DMSO），室溫?fù)u床10 min，酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

以上試驗(yàn)均以缺氧復(fù)氧損傷的乳鼠心肌細(xì)胞篩選，并以心肌細(xì)胞的損傷抑制率作為指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)作用效果的優(yōu)劣，損傷抑制率=（OD試驗(yàn)-OD損傷）/OD損傷×100%。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，行t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 存活心肌細(xì)胞確認(rèn)倒置顯微鏡下，心肌細(xì)胞呈圓形，懸浮。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，未染藍(lán)色為活細(xì)胞，顯示心肌細(xì)胞存活率達(dá)96%。4 h后開(kāi)始逐漸貼壁，初為圓形，后為梭形，細(xì)胞在瓶壁逐漸展開(kāi)，伸出偽足，變?yōu)槿切?、多邊形等不?guī)則的形態(tài)。24 h后可見(jiàn)細(xì)胞陸續(xù)伸出偽足，細(xì)胞團(tuán)最先開(kāi)始搏動(dòng)，隨后，可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率各異，多在50～120次／min。48 h后大部分細(xì)胞都伸出偽足，形成不規(guī)則的星形，同步搏動(dòng)頻率為60～90次/min。

2.7.2 提取溶媒的結(jié)果結(jié)果顯示，以水作為提取溶媒時(shí)，損傷抑制率最大，說(shuō)明水是最佳提取溶媒。見(jiàn)表2。

表2 提取溶媒對(duì)損傷抑制率的影響

2.7.3 正交試驗(yàn)的結(jié)果結(jié)果顯示，正交4組的損傷抑制率最大，可作為最佳的提取條件。見(jiàn)表3、4、5。

表3 各正交試驗(yàn)組對(duì)損傷抑制率的影響

2.7.4 靜態(tài)吸附的結(jié)果結(jié)果顯示，選用HPD-300效果最佳。見(jiàn)表6。

表4 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)直觀分析表

表5 方差分析表

表6 靜態(tài)吸附對(duì)損傷抑制率的影響

2.7.5 靜態(tài)解析的結(jié)果結(jié)果顯示，選用HPD-300最佳。見(jiàn)表7。

表7 靜態(tài)解析對(duì)損傷抑制率的影響

2.7.6 泄露曲線的結(jié)果結(jié)果顯示，9 BV為最佳的上樣量。見(jiàn)表8。

2.7.7 動(dòng)態(tài)解析洗脫溶媒考察的結(jié)果結(jié)果顯示，50%醇為最佳的洗脫溶媒。見(jiàn)表9。

2.7.8 動(dòng)態(tài)解析洗脫溶媒的考察的結(jié)果結(jié)果顯示，5BV為最佳的洗脫溶媒量。見(jiàn)表10。

綜上可知，根據(jù)以上靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，采用體外篩選方法，各組的OD值與損傷組OD值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；通過(guò)比較損傷抑制率，篩選出的川芎治療冠心病的有效成分的最佳提取工藝為6倍量的水，提取2次，提取1 h；純化工藝為15 ml的HPD-300樹脂，9 BV的0.5 g/ml的藥液，以5 BV的50%醇洗脫，純化收率達(dá)到最大值。

表8 泄露曲線中上樣量對(duì)損傷抑制率的影響

表9 動(dòng)態(tài)解析洗脫溶媒對(duì)損傷抑制率的影響

表10 動(dòng)態(tài)解析洗脫溶媒對(duì)損傷抑制率的影響

3 討論

原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題包括：①取材應(yīng)該盡量取出生1～3 d的大鼠，出生時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的大鼠，心肌的活性不好，很大程度上影響了心肌的生長(zhǎng)；②消化液的選擇：胰蛋白酶的消化能力很強(qiáng)，但很容易損傷心肌細(xì)胞，本文選擇膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶的混合液，既可以將心肌細(xì)胞最大程度的消化，又不會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷；③差數(shù)貼壁：利用心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同，將二者分離，使心肌細(xì)胞的純度能達(dá)到90%以上。

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是指心肌缺血后再灌注期間導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損害，川芎中的阿魏酸為治療冠心病的主要成分，阿魏酸能抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放，抑制血小板血栓素A2（TXA2）的生成，能降低心肌缺血量和耗氧量，在臨床上被用于治療冠心病、心絞痛，而且其水溶性較好，因此本試驗(yàn)選擇水做為提取溶劑，結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞篩選出了川芎治療冠心病的有效成分最佳的提取工藝。

川芎所含化學(xué)成分復(fù)雜，含有阿魏酸、揮發(fā)油、多糖等十幾類成分，而其主要有效成分阿魏酸含量較低，故阿魏酸的富集、精制、純化存在一定的難度。本文采用大孔吸附樹脂吸附法富集與純化阿魏酸，從吸附和解吸方面分析，結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞的損傷抑制率明顯提高，說(shuō)明大孔樹脂吸附法基本適宜于川芎中阿魏酸的分離、富集與純化。而且HPD-300型大孔樹脂具有吸附快、解吸率高、吸附容量大、洗脫率高、再生簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在分離、富集、純化中藥材主要成分方面有一定的推廣價(jià)值，也是克服中藥新藥開(kāi)發(fā)研究中制備工藝水平低的難題可嘗試的技術(shù)。

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The research of extraction and purification process of active ingredients of Chuanxiong which could treat coronary heart disease through screening methods in vitro

REN Cong,MENG Xiansheng,BAO Yongrui
College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Dalian 116600,China

Objective:To select the best extraction and purification process of active ingredients of Chuanxiong which could treat the coronary heart disease through screening methods in vitro.Methods:Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes and sodium hydrosulfite (Na2S2O4)were used for hypoxia 1 h and reoxygenation 1 h to form the cardiomyocyte hypoxia-reoxygenation injury model to simulated in vivo ischemia-reperfusion injury.Screening methods in vitro were used to select the best extraction and purification process of active ingredients of Chuanxiong which could treat coronary heart disease.Results:The best extraction process selected was that,Chuanxiong was extracted for 2 times,1 h for each time with 6 times the amount of water;while the purification process was that,15 ml HPD-300 resin was used,9 BV of 0.5 g/ml of the Chuanxiong extract and 5 BV of 50%ethanol was applied to elute.Conclusions:The technology of extraction and purification through screening methods in vitro has high reliability,and provides a basis for the development of new drug that treat cardiovascular disease.

Chuanxiong;Extraction;Purification;Primary neonatal rat cardiomyocytes;Coronary heart disease;Sodium hydrosulfite

R284.2

A

1673-7210（2011）12（b）-081-04

“十一五”重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)：2010ZX09401-304-515）。

任聰（1985.12-），女，漢族，碩士研究生；研究方向：藥物分析。

孟憲生（1964.04-），男，漢族，副教授；研究方向：中藥組分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析。

2011-07-25）