何勇琴，潘迎捷，盧 瑛

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

食品中單核細胞增生性李斯特菌的快速分離鑒定

何勇琴，潘迎捷，盧 瑛*

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌)是一種重要的食源性致病菌，能引起人畜共患李斯桿菌病。本文采用兩種不同的增菌分離方法從散裝牛奶和豬肉中共分離得到8株單增李斯特菌。通過革蘭氏染色、生化鑒定、PCR擴增hlyA基因、16S rDNA測序、血清分型等一系列實驗對可疑菌株進行分析鑒定。綜合實驗結(jié)果和其他單增李斯特菌分離標(biāo)準(zhǔn)，探討開發(fā)了一種快速分離鑒定單增李斯特菌的方法，該方法可在4～5d內(nèi)完成單增李斯特菌的分離檢測過程。

單增李斯特菌，快速，分離，鑒定，hlyA基因，血清分型

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品1 豬肉，購于上海黃浦區(qū)徽寧路菜市場菜市場;樣品2 散裝牛奶，購于上海郊區(qū);胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE)、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)、BLEB基礎(chǔ)及相應(yīng)添加劑、Fraser肉湯基礎(chǔ)及添加劑、牛津瓊脂(OXA)基礎(chǔ)(Oxford Agar Base)及相應(yīng)添加劑、PALCAM培養(yǎng)基基礎(chǔ)及相應(yīng)添加劑 根據(jù)產(chǎn)品說明進行配制;單增李斯特菌生化鑒定套裝 以上產(chǎn)品均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任有限公司;BioFlux DNA提取試劑盒 購自杭州博日科技有限公司;李斯特菌抗血清試劑 購自日本Denka Seiken公司。

1.2 實驗方法

實驗采用了2種方法從樣品中分離單增李斯特菌。其中樣品1參照FDA的分離方法，采用了BLEB增菌液和OXA選擇性培養(yǎng)基，樣品2參照ISO的分離方法，采用了Fraser肉湯增菌液和PALCAM選擇性培養(yǎng)基，此兩種方法的區(qū)別在于前增菌和分離方法的不同，鑒定方法完全一致。

1.2.1 預(yù)增菌處理 稱取25g樣品1，放入均質(zhì)袋，加入225mL無菌生理鹽水，均質(zhì)拍打2min。取25mL樣品2加入225mL無菌生理鹽水，混勻。取樣品1的均質(zhì)液25mL，無菌條件下加入到225mL的BLEB增菌液中，30℃搖床培養(yǎng)4h，加入選擇性試劑吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮，30℃搖床培養(yǎng)48h。

取樣品2的均質(zhì)液25mL，無菌條件下加入到225mL的Half Fraser肉湯中，30℃搖床培養(yǎng)24h，取1mL培養(yǎng)液，加入到10mL Fraser肉湯中，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。

1.2.2 分離純化 取樣品1的48h增菌液劃線接種于OXA瓊脂平板，36±1℃培養(yǎng)48h。

樣品2的二次增菌液若變黑，梯度稀釋增菌液，選取合適的梯度稀釋液0.1mL涂布于PALCAM瓊脂平板，36±1℃培養(yǎng)48h。

挑取上述兩種平板的可疑菌落劃線接種于TSA-YE瓊脂平板。

1.2.3 革蘭氏染色和生化鑒定 挑取TSA-YE瓊脂平板上已純化單菌落進行革蘭氏染色和生化鑒定，生化鑒定包括TSI三糖鐵實驗、硝酸鹽肉湯、MRVP、尿素酶、糖發(fā)酵實驗(七葉苷、木糖、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露醇)。

1.2.4 PCR擴增hlyA基因 將TSA-YE瓊脂平板上菌落接種于TSB-YE，30℃搖床培養(yǎng)15h。按照試劑盒提取可疑菌落的DNA。針對單增李斯特菌的溶血毒素基因hlyA，參考文獻［6］合成hlyA基因引物。上游:5'-ACGCAGTAAATACATTAGTG-3'，下游: 5'-AATAAACTTGACGGCCATAC-3'。上、下游引物由上海生物工程有限公司合成，擬擴增片段大小為372bp。PCR反應(yīng)體系:DNA模板1.0μL、25μmol/L上下游引物各1.0μL、2.5mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL、10倍緩沖液2.0μL(含 Mg2+)、去離子水13.8μL，總體積20μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min;94℃ 30s，58℃30s，72℃ 1min，30個循環(huán);72℃延伸7min，10℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)中讀取擴增結(jié)果。

1.2.5 16S rDNA測序 以1.2.4中提取的DNA為模板，采用16S rDNA的通用引物進行PCR擴增，產(chǎn)物交由上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.2.6 血清型鑒定 可疑菌落的血清型鑒定參照李斯特菌抗血清試劑說明書。O抗原采用玻片凝集的方法，H抗原采用試管凝集的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 增菌結(jié)果

樣品1在BLEB增菌液中培養(yǎng)48h后，除明顯渾濁外無其他現(xiàn)象。樣品2在Half Fraser肉湯中增菌24h，增菌液變黑。這主要是因為Half Fraser肉湯中含有七葉苷，所有的李斯特菌都可以水解七葉苷，水解產(chǎn)物和添加劑中的檸檬酸鐵銨產(chǎn)生顏色反應(yīng)，使菌液變黑，以此可初步判斷李斯特菌的存在，具體結(jié)果見表1。若24h菌液未變黑，繼續(xù)培養(yǎng)24h，仍未出現(xiàn)黑色現(xiàn)象，可視為無李斯特菌的存在。

2.2 分離純化

樣品1劃線于OXA瓊脂平板培養(yǎng)48h后，平板上出現(xiàn)直徑約1mm的黑色菌落。此時可初步判斷李斯特菌的存在。樣品2經(jīng)48h增菌后基本可以斷定有李斯特菌的存在，涂布于PALCAM平板上，平板上出現(xiàn)小的灰綠色菌落，外圍有水解環(huán)，進一步證明李斯特菌的存在。

2.3 革蘭氏染色和生化鑒定結(jié)果

OXA和PALCAM平板上共挑選出8個可疑菌落。TSA-YE平板上可疑菌落鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陽性。8個可疑菌落生化鑒定結(jié)果完全一致，且和標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化反應(yīng)現(xiàn)象也完全一樣(見表1)。TSI三糖鐵斜面和底部均變黃，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷，不發(fā)酵木糖、甘露醇，MR-VP陽性，硝酸鹽肉湯和尿素酶均為陰性。

2.4 PCR擴增結(jié)果

8株實驗室分離的單增李斯特菌PCR檢測全部呈陽性，在400bp附近出現(xiàn)目的條帶，和預(yù)期片段大小(372bp)相吻合，而其它兩株同屬異種菌未出現(xiàn)目的條帶，其中陰性對照2盡管出現(xiàn)3條非特異性條帶，但和目的條帶相差甚遠，對實驗結(jié)果的判斷干擾甚微。電泳結(jié)果見圖1。

圖1 單增李斯特分離株P(guān)CR結(jié)果注:M:DL-100標(biāo)樣;1:空白;2、3:陰性對照，為英諾克李斯特菌食品分離株; 4:單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7644; 5～12:Listeria monocytogenes分離株。

2.5 DNA測序結(jié)果

16S rDNA測序結(jié)果顯示，8株可疑菌株均為單增李斯特菌。

表1 革蘭氏染色和生化鑒定結(jié)果

表2 不同預(yù)增菌和分離純化方法的比較

2.6 血清型鑒定結(jié)果

綜合O抗原和H抗原的反應(yīng)結(jié)果，8株可疑菌落的血清型均為1/2a。

3 討論

通過單增李斯特菌兩種不同分離純化方法的比較可知，采用Fraser肉湯增菌液可以在較短的時間(24～48h)內(nèi)斷定李斯特菌的存在與否，這也是采用Fraser肉湯增菌液的優(yōu)點所在。在24h和48h的關(guān)鍵點處，可以判斷樣品中單增李斯特菌的存在情況并對后續(xù)實驗進行相應(yīng)安排，節(jié)約分離時間和成本。推薦采用Fraser肉湯增菌液，盡管可能會出現(xiàn)漏檢的情況，但由于實驗的目的是大量分離單增李斯特菌，所以可以忽略漏檢的因素。OXA或PALCAM平板培養(yǎng)基，在實際的分離工作中，二者的分離效果未見明顯差異，均可準(zhǔn)確分離增菌液中的李斯特菌，因此，在實際的工作中，二者任選其一即可。

本研究在單增李斯特菌的鑒定方面采用了傳統(tǒng)和快速鑒定相結(jié)合的方法，一方面保證了結(jié)果的正確性;另一方面快速鑒定方法的可行性和真實性可以通過傳統(tǒng)方法得到驗證。鑒于經(jīng)濟節(jié)約的大量分菌目的，在實際大量樣本的分菌工作中，革蘭氏染色和生化鑒定可以略去，因為 Fraser肉湯增菌液和PALCAM(或OXA)選擇性培養(yǎng)基的雙重篩選作用，基本上保障了90%以上的準(zhǔn)確性。就PCR擴增而言，hlyA基因是單增李斯特菌所特有的毒力標(biāo)志基因［7-9］，從理論上保證了PCR擴增檢測單增李斯特菌的正確性。實際的擴增過程也充分證實了PCR鑒定的準(zhǔn)確性，因此PCR擴增hlyA基因完全可以作為單增李斯特菌的鑒定指標(biāo)之一。

本實驗的不足之處在于DNA提取方面，采用了試劑盒提取的方式。試劑盒的方法一定程度上保證了DNA的得率，但用時較長需3h，且費用相對較高，因此建議在大規(guī)模分菌時采用其他更為快速簡便的DNA提取方法，以進一步節(jié)約時間和費用。

綜上所述，采用Fraser肉湯增菌液結(jié)合PALCAM (或OXA)選擇性培養(yǎng)基與PCR擴增(或16S rDNA測序)三大步驟就可以從環(huán)境或食品樣本中快速分離鑒定出單增李斯特菌。在單增李斯特菌的分離鑒定方面，行標(biāo)SN/T0184.1-2005需要5～6d，國標(biāo)GB/T 4789.30-2008則需要11～16d的時間，而采用本文的三大分離步驟，可以在4～5d內(nèi)完成單增李斯特菌分離鑒定的整個過程，且可在48h內(nèi)基本確定食品中是否存在李斯特菌，根據(jù)該判定結(jié)果進行實驗設(shè)計和優(yōu)化，可大大簡化分離鑒定步驟，降低成本。因此，我們認為本文的方法不僅適合于大量樣本中單增李斯特菌的分離鑒定工作，且適用于一般實驗室的單增李斯特菌分離純化工作。

［1］馬里奧特.食品衛(wèi)生原理［M］.第4版.北京:中國輕工業(yè)出版社，2001.

［2］Chaems，Schraft H.Comparative evaluation of adhesion and biofilmformation of different Listeria monocytogenes strains［J］.Int J Food Microbiol，2000，62(2):103-111.

［3］Norwood DE，GilmourA.The growth and resistance to sodium hypochlorite ofListeria monocytogenesin a steady-state multispecies biofilm［J］.Appl Microbiol，2000，88(3):512-520.

［4］VAZQUEZ-BOLAND JOSEA，KUHN MICHAEL，BERCHE PATRICK，et al.Listeria Pathogenesis and Molecular Virulence Determiants［J］.Clinical Microbiology Reviews，2001，14(3): 584-640.

［5］王連秀，趙維勇，牛恒彩，等.食品中單核細胞增生李斯特氏菌調(diào)查及毒力研究［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2001，13(2): 16-18.

［6］宮照龍，祝仁發(fā)，葉長蕓，等.118株單核細胞增生李斯特菌的毒力基因檢測［J］.疾病監(jiān)測，2007，22(5):299-301

［7］董慧，焦新安，殷月蘭，等.抗李斯特菌溶血素單克隆抗體的制備及初步鑒定［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2008，24(3): 240-246.

［8］ AZNAR R，ALARCON B.PCR detection Listeria monocytogenes:a study of multiple factors affecting sensitivity［J］.Appl Microbiol，2003，95(5):958-966.

［9］任艷紅，李一經(jīng)，王新生，等.單核細胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及序列分析［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，35 (1):46-48.

Rapid isolation and identification of Listeria monocytogenes in foods

HE Yong-qin，PAN Ying-jie，LU Ying*
(College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

Listeria monocytogenes is an important food-borne pathogenic which can cause listeriosis both in human and animals.8 Listeria monocytogenes were isolated from bulk milk and pork using two different enrichmentisolation methods.A series of experiments(Gram stain，biochemical identification，PCR amplification of hlyA gene，16S rDNA sequencing and serotyping)were employed to analyze and identify the suspicious colonies.A rapid method to isolate and identify Listeria monocytogenes was developed on the basic of the experimental results and the other separation standards.The detection process can be completed within 4～5d using the above method.

Listeria monocytogenes;rapid;isolation;identification;hlyA gene;serotyping

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0215-04

單核細胞增生性李斯特菌(簡稱單增李斯特菌)是一種重要的食源性致病菌，能在冷藏溫度下繁殖，因其細胞的苯酚水浸出物可以誘導(dǎo)單核細胞的生成，從而獲得了“單核細胞增生細菌”這個種名［1］。該菌分布廣泛，對不利因素如低溫、高滲、抗菌物質(zhì)有抵抗作用，還能在物體表面形成生物膜［2-3］。據(jù)報道，4%～8%的水產(chǎn)品，5%～10%的奶及其產(chǎn)品，30%以上的肉制品及15%以上的家禽可被該菌污染。美國、加拿大等國曾多次爆發(fā)由該菌引起的食物中毒事件，死亡率達30%以上［4］。由于單增李斯特菌引起的感染病死率高，危害大，引起了國際上的高度重視。WHO將其列為20世紀(jì)90年代四大食源性致病菌之一［5］，并在2000年建立了全球監(jiān)測網(wǎng)，在世界范圍內(nèi)開展與食源性致病菌相關(guān)疾病的監(jiān)測。1994年我國頒布了食品中單增李斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法，并于2003年、2008年分別做了進一步的修改，但目前我國對單增李斯特菌的廣泛種群特征及其生態(tài)分布方面的調(diào)查尚未見到報道。鑒于這種現(xiàn)狀，廣泛采集各種環(huán)境和食品樣品，分離鑒定其中的單增李斯特菌，并探討該菌在環(huán)境以及食品中的分布狀況，研究該菌的污染狀況以及分布特征可以為預(yù)防李斯特菌病的爆發(fā)、流行及追蹤污染源提供理論依據(jù)。本文在2008年最新修改單增李斯特菌國標(biāo)的基礎(chǔ)上，結(jié)合FDA(Food and Drug Administration)和ISO (International Organization for Standardization)的檢測方法，比較研究了兩種預(yù)增菌和分離純化的方法，采用傳統(tǒng)和快速鑒定相結(jié)合的方式驗證可疑菌株，旨在探討開發(fā)一種更為經(jīng)濟效率高的適于大量樣本的單增李斯特菌分離鑒定方法。

2010-03-10 *通訊聯(lián)系人

何勇琴(1985-)，女，碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)與工程。

上海海洋大學(xué)博士啟動基金(B-8203-08-0220);上海市教委創(chuàng)新項目(09YZ274);國家科技支撐計劃項目(2008BAD94B09)。