陳偉洲，宋彩霞，陳美珍，*

(1.汕頭大學(xué)海洋生物研究所，廣東汕頭515063;2.汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東汕頭515063)

響應(yīng)面法優(yōu)化海蓬子多糖提取工藝的研究

陳偉洲1，宋彩霞2，陳美珍2，*

(1.汕頭大學(xué)海洋生物研究所，廣東汕頭515063;2.汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東汕頭515063)

為優(yōu)化海蓬子多糖的水法提取工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法，研究水料比、提取時(shí)間、提取溫度對海蓬子多糖提取率的影響，建立多糖提取得率的二次回歸方程，并對其工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明:水提海蓬子多糖的最佳工藝參數(shù)為水料比48∶1，提取時(shí)間4.0h，提取溫度90℃。在該條件下提取一次，多糖得率為2.0%，而理論預(yù)測多糖得率是2.01%，實(shí)際得率達(dá)到理論預(yù)測值的99.5%。

海蓬子，多糖，提取，響應(yīng)面設(shè)計(jì)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海蓬子干粉 新鮮海蓬子，由廣東省汕頭大學(xué)南澳海洋實(shí)驗(yàn)站提供，采集時(shí)間為2009年4～5月，海蓬子采摘后取可食莖部，除雜去沙后，洗凈，晾干，于50～60℃下烘干，粉碎過20目篩后即為海蓬子干粉，低溫保存，備用;濃硫酸、苯酚、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸(DNS)等 均為分析純。

5417R臺式高速冷凍離心機(jī) Eppendorf公司;日立CT5DL型離心機(jī) Tokyo公司;DHG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥器、UNICO-UV2100型分光光度計(jì)尤尼柯儀器有限公司;DK-S22型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海蓬子多糖提取 準(zhǔn)確稱取海蓬子粉末2.00g，按設(shè)定的水料比加入蒸餾水，在設(shè)定的溫度下恒溫?cái)嚢杼崛?～5h后，于5000r/min離心20min，上清液為待測溶液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以水為提取液，選取浸取溫度、時(shí)間和水料比三因素進(jìn)行研究，按照1.2.1方法提取海蓬子多糖，并計(jì)算得率。

1.2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)［9］，各因素編碼值見表1。以多糖的提取得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析及嶺脊分析對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平編碼表

1.2.4 提取液多糖含量的測定［10-11］先采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品(用0.9的系數(shù)校正)，再采用DNS法測定還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 時(shí)間對多糖提取得率的影響 保持80℃、水料比25∶1，提取一次，研究提取時(shí)間對多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對多糖提取得率的影響

由圖1可知，多糖提取得率隨著提取時(shí)間的延長，呈現(xiàn)整體上升的趨勢。在本實(shí)驗(yàn)所選提取時(shí)間范圍內(nèi)，提取得率沒有極值點(diǎn)，且提取5h比4h得率有較大提高，但考慮到長時(shí)間加熱耗時(shí)耗能，還有可能導(dǎo)致多糖變性，因此，提取時(shí)間以5h左右為宜。

2.1.2 水料比對多糖提取得率的影響 設(shè)定提取時(shí)間3h，提取溫度80℃，提取一次，研究水料比10∶1～70∶1對提取得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，多糖得率隨水料比的增加而增加，但到水料比為40∶1后增加緩慢。考慮到溶劑用量過大，水浴加熱的負(fù)荷增大，并且會給后續(xù)工作增加負(fù)擔(dān)，所以認(rèn)為水料比以40∶1較為合適。

2.1.3 溫度對多糖提取得率的影響 保持提取時(shí)間3h、水料比25∶1不變，提取一次，探討溫度對海蓬子多糖提取得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2 水料比對多糖提取得率的影響

圖3 溫度對多糖提取得率的影響

由圖3可見，隨著溫度的升高，多糖的得率逐漸增加，到100℃達(dá)到最大值。這可能是伴隨溫度的升高，原料溶脹度增大，傳質(zhì)強(qiáng)化，從而使得多糖的溶出率增加。但從90℃到100℃多糖提取得率增加不多，從溫度對多糖穩(wěn)定性的影響和能耗等綜合考慮，多糖的提取以90℃為宜。

2.2 響應(yīng)面分析法對海蓬子多糖提取工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果 對表1所列的水料比Z1，提取時(shí)間Z2和Z3作如下變換:X1=(Z1-50)/10，X2=(Z2-4)/1，X3=(Z3-80)/10，以Xl、X2、X3為自變量，以多糖得率(Y1)為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3分析結(jié)果可知，回歸模型(p=0.0028＜0.01)和一次項(xiàng)(p=0.0012＜0.01)均高度顯著，二次項(xiàng)(p=0.0118＜0.05)和交互項(xiàng)(p=0.012＜0.05)顯著，表明回歸模型可以很好地反映多糖提取得率與因素的關(guān)系。此外，回歸模型R2=96.94%，說明回歸模型和預(yù)測值之間有較好的擬合度。因此該模型可用于預(yù)測多糖提取得率的實(shí)際情況。

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 擬合回歸方程的建立 對響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合，回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表4，回歸擬合后得回歸方程:

表4 回歸方程系數(shù)檢驗(yàn)

2.2.3 各因素的重要性分析 通過模型方程作響應(yīng)曲面圖，結(jié)果如圖4～圖6。比較三組圖可知，溫度(X3)對多糖提取得率的影響比較顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;水料比(X1)和時(shí)間(X2)對多糖提取得率的影響比較小，表現(xiàn)為隨X1和X2的增加，其響應(yīng)值變化較小。

圖4 Y=f(X2，X3)的響應(yīng)面圖

圖5 Y=f(X1，X3)的響應(yīng)面圖

由回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性分析結(jié)果見表5。從表5可以看出，三個(gè)因素的特征值有正有負(fù)，表明此二次響應(yīng)面是鞍面，無極值存在，因此不能直接從此二次響應(yīng)面上找出最佳工藝參數(shù)，需要進(jìn)一步作嶺脊分析。

圖6 Y=f(X1，X2)的響應(yīng)面圖

表5 典型值分析表

2.2.4 嶺脊分析 嶺脊分析的原理是以原始設(shè)計(jì)中心點(diǎn)為球心，r為半徑的超球面與響應(yīng)面的交點(diǎn)形成的軌跡范圍內(nèi)找出最佳響應(yīng)值，即最佳條件。嶺脊分析結(jié)果見表6。

從表6可以看出，隨著r值增大，預(yù)估響應(yīng)值隨之增大，最大響應(yīng)值時(shí)的編碼半徑為1.0，此時(shí)的水料比為48.4∶1，時(shí)間為4.00h，溫度為89.87℃。

表6 嶺脊分析結(jié)果

2.2.5 模型的驗(yàn)證 對上述優(yōu)選的多糖提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮實(shí)際操作的便利，將多糖提取的最優(yōu)條件修正為:水料比48∶1，時(shí)間4h，溫度90℃。在此條件下提取多糖，多糖的得率為2.00%，與理論預(yù)測值2.01%接近。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的多糖提取參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于海蓬子多糖提取工藝條件的研究，確定海蓬子多糖的最佳提取工藝參數(shù)為:水料比48∶1，提取時(shí)間4.0h，提取溫度90℃，最大提取得率預(yù)測值為2.01%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對海蓬子多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用有較好的參考價(jià)值。

［1］呂忠進(jìn)，Edward P Glenn，Roy M Hodges，et al.全海水灌溉的作物——北美海蓬子(上)［J］.世界農(nóng)業(yè)，2001(2):14-16.

［2］呂忠進(jìn)，Edward P Glenn，Roy M Hodges，et al.全海水灌溉的作物——北美海蓬子(下)［J］.世界農(nóng)業(yè)，2001(2):19-20.

［3］Millman.Trendy sprout thrives on water from the sea［J］.The Wall Street Journal，2003，26(2):1-3.

［4］蔡金龍，駱江蘭，周祥，等.海蓬子的開發(fā)應(yīng)用初探［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007(20):60.

［5］Lee Kun Yeong，Lee Mee Hong，Chang In Youb，et al. Macrophage activation by polysaccharide fraction isolated from Salicornia herbacea［J］.Ethnopharmacology，2006，103:372-378.

［6］Im Sun-A，Kim Kyungjae，Lee Chong-Kil.Immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Salicornia herbacea［J］. International Immunopharmacology，2006(6):1451-1458.

［7］Im Sun-A，Lee Young-Ran，Lee Young-Hee，et al. Synergistic activation of monocytes by polysaccharides isolated from Salicornia herbacea and interferon - γ ［J］ . Ethnopharmacology，2007，111:365-370.

［8］陳美珍，宋彩霞，陳偉洲，等.海蓬子提取物體外抗氧化活性的研究［J］.食品科學(xué)，2009(21):71-74.

［9］洪楠.SAS for Windows［M］.第8版.北京:北京交通大學(xué)出版社，2004:540-550.

［10］孫培龍.姬松茸多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤活性研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2007:29-31.

［11］李亞娜，林永成，佘志剛.響應(yīng)面分析法優(yōu)化羊棲菜多糖的提取工藝［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32(11):28-32.

Optimization of extraction technology of Salicornia bigelovii Torr.polysaccharides by response surface methodology

CHEN Wei-zhou1，SONG Cai-xia2，CHEN Mei-zhen2，*
(1.Marine Biology Institute，Shantou University，Shantou 515063，China; 2.Department of Biology，College of Science，Shantou University，Shantou 515063，China)

The extraction of polysaccharides from Salicornia bigelovii Torr.was studied in this paper.According to the single-factor experiments，three levels of the factors(extraction temperature，time and the ratio of water to solid) were selected for the Box-Behnken factorial design to establish a quadric regression equation for describing the yield of polysaccharides.By response surface analysis，the optimum extraction conditions were obtained as follows:extraction temperature of 90℃，extraction time of 4.0h and water-pueraria residue ratio of 48∶1，under which the experimental yield(2.0%)of polysaccharides accounts for 99.5%of the theoretically predicted value of 2.01% with one-time extraction.

Salicornia bigelovii Torr.;polysaccharides;extraction;response surface analysis

TS201.2+3

B

1002-0306(2011)03-0318-04

海蓬子 (SalicorniabigeloviiTorr.)為藜科(Chenopodiaceae)鹽角草屬(Salicornia)的無葉、莖肉質(zhì)化的真鹽生植物，俗稱海蘆筍、海蟲草等，原產(chǎn)美洲鹽沼地，是一種無公害的綠色新型海水蔬菜［1-2］，在歐美一些國家已經(jīng)有產(chǎn)品面世，并得到人們的喜愛［3］。海蓬子富含多種營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)［4］，除作為蔬菜之外，還具有藥用和保健價(jià)值。海蓬子作為民間藥物可用于治療癌癥、糖尿病、肥胖癥和便秘等多種疾?。?-7］。國外研究發(fā)現(xiàn)海蓬子多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，并認(rèn)為此活性可能是海蓬子抗癌機(jī)理之一［5-7］。作者對產(chǎn)于廣東南澳縣海蓬子的水提物、醇提物及水提多糖的研究表明海蓬子多糖具有體外抗氧化活性［8］。但目前國內(nèi)外對海蓬子多糖的研究仍然很少，有關(guān)海蓬子多糖的提取利用等報(bào)道幾乎是空白。本實(shí)驗(yàn)在對海蓬子多糖的提取條件單因素研究的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化選擇，以期能充分地提取海蓬子多糖。

2010-01-27 *通訊聯(lián)系人

陳偉洲(1971-)，男，高級工程師，研究方向:水產(chǎn)養(yǎng)殖。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B090400461)。