張?jiān)撇?，?奇，武有聰，郭利軍，申元英，白 麗

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

HIV相關(guān)性口腔白色念珠菌rDNA基因型研究

張?jiān)撇?，?奇，武有聰，郭利軍，申元英，白 麗*

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：了解HIV感染人群和健康人群口腔白色念珠菌基因型的分布情況。方法：運(yùn)用CA-INT特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)方法擴(kuò)增白色念珠菌包含1類內(nèi)含子的編碼rRNA的25S rDNA區(qū)，根據(jù)擴(kuò)增條帶大小進(jìn)行基因分型，并應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)54株HIV感染人群和54株健康人群口腔白色念珠菌基因型別進(jìn)行分析。結(jié)果：CA-INT特異性引物PCR法可將108株口腔白色念珠菌分為A、B和C型，以A型最多見，兩組人群口腔白色念珠菌基因型分布基本相同，但HIV感染人群口腔白色念珠菌A型所占構(gòu)成比高于健康人群，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：HIV感染人群和健康人群口腔白色念珠菌均具有基因多態(tài)性，CA-INT特異性引物PCR法是較好的口腔白色念珠菌種內(nèi)菌株間鑒定的方法。

白色念珠菌；HIV；聚合酶鏈反應(yīng)；rDNA基因型

口腔念珠菌?。╫ral candidiasis，OC）是一組由念珠菌屬感染所引起的口腔粘膜疾病，然而在口腔念珠菌感染中又以白色念珠菌（Candida albicans，CA）為最主要的條件致病菌。OC是HIV感染人群最常見的并發(fā)癥之一，機(jī)體一旦出現(xiàn)OC預(yù)示疾病即將從HIV感染期進(jìn)入至AIDS發(fā)病階段，故其是早期發(fā)現(xiàn)和診斷AIDS的重要線索〔1〕。從基因水平對(duì)口腔白色念珠菌菌株間差異進(jìn)行基因分型研究，能克服表型研究出現(xiàn)的缺點(diǎn)，無(wú)疑是能更好認(rèn)識(shí)到OC流行病學(xué)的意義。本文采用特異性引物PCR分型方法，以分離來(lái)自HIV感染人群口腔白色念珠菌為研究對(duì)象，健康人群口腔白色念珠菌為對(duì)照，擴(kuò)增白色念珠菌包含1類內(nèi)含子的編碼rRNA的25S rDNA區(qū)，以探討2組人群口腔白色念珠菌基因型分布情況，并為HIV感染人群的OC分子流行病學(xué)研究提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料 分離自云南大理地區(qū)HIV感染人群和健康人群的口腔念珠菌，經(jīng)形態(tài)染色、培養(yǎng)特性、芽管形成實(shí)驗(yàn)、假菌絲及厚膜孢子形成實(shí)驗(yàn)、YBC酵母鑒定卡及CHROMagar培養(yǎng)基培養(yǎng)綜合鑒定為白色念珠菌，其中HIV感染人群分離到54株口腔白色念珠菌，健康人群分離到54株口腔白色念珠菌，質(zhì)控菌株為ATCC10231（本教研室提供）。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA提取 參照文獻(xiàn)〔2〕修改后進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)菌株在沙氏瓊脂培養(yǎng)基激活2次后，取單個(gè)菌落（直徑2 mm）加入含0.5 mL無(wú)菌去離子水的離心管中，然后室溫離心后，棄去上清；加入0.5 mL 0.25M Tris（pH8.0）-1.5%SDS裂解液，恒溫混勻儀上加熱100℃30 min，后搖勻2 min；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）（pH＞7.8）混勻，室溫離心后取上清；加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2.2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻；室溫離心后，棄去上清，加入1 mL冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA后，室溫離心，棄去上清；室溫干燥后用30 μl 1×Tris-EDTA（pH7.6）重懸DNA，然后-20℃保存?zhèn)溆?；用紫外分光光度?jì)測(cè)定OD260/OD280，估計(jì)DNA純度和濃度，比值控制在1.8～2.1范圍較理想，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 針對(duì)白色念珠菌25S rDNA轉(zhuǎn)座內(nèi)含子保守序列分型，特異性引物參考文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)。特異性引物：CA-INT-R（5′-CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3′）和 CA-INT-L（5′-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGAT-CCGTAA-3′）（上海生工生物工程公司合成）。PCR反應(yīng)條件參照2×Taq PCR MasterMix擴(kuò)增試劑盒（購(gòu)自北京天根生化科技有限公司）進(jìn)行，反應(yīng)總體積為25 μL，1 μL模板（＜1 μg），1 μl CA-INT-R（10 μM），1 μl CA-INT-L（10 μM），12.5 μL 2×MasterMix，ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置：94℃預(yù)變性3min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照相分析，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中450 bp和840 bp的有無(wú)將白色念珠菌分為3種基因型，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)2組人群口腔白色念珠菌基因型別進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)CA-INT特異性引物PCR方法擴(kuò)增后，2組人群的口腔白色念珠菌均可擴(kuò)增出450 bp、840 bp或二者皆有的片段，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中450 bp和840 bp的有無(wú)將兩組人群的口腔白色念珠菌基因型分為3型：A型（450 bp），B型（840 bp），C型（450 bp和840 bp）。見圖1。2組人群口腔白色念珠菌CA-INT引物PCR分型結(jié)果，見表1。2組人群均以A型白色念珠菌最為多見，標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231也屬于A型，另外B型次之以及C型較少。

表1 兩組人群口腔白色念珠菌CA-INT引物PCR分型結(jié)果

圖1 白色念珠菌25Sr DNA-PCR的部分圖譜

2.2 統(tǒng)計(jì)分析 HIV感染人群口腔白色念珠菌中A型所占構(gòu)成比大于健康人群口腔白色念珠菌中A型所占構(gòu)成比（表1），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而HIV感染人群口腔白色念珠菌中B型所占構(gòu)成比小于健康人群口腔白色念珠菌B型所占構(gòu)成比，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＞0.05，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HIV感染人群口腔白色念珠菌中C型所占構(gòu)成比小于健康人群口腔白色念珠菌C型所占構(gòu)成比，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＞0.05，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIV感染人群和健康人群的口腔白色念珠菌基因型別分布經(jīng)SPSS17.0 χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示：χ2=4.282，P=0.118，按P=0.05水準(zhǔn)，兩組間A、B和C基因型別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

隨著白色念珠菌感染在臨床病例中不斷增加，耐藥現(xiàn)象逐漸突出，對(duì)白色念珠菌病流行病學(xué)及合理選擇抗真菌藥物的研究顯得十分重要。近年來(lái)，PCR分型方法已被廣泛的應(yīng)用于對(duì)念珠菌間的DNA核苷酸序列的差異進(jìn)行基因分析研究，用于臨床分離株快速分型，追蹤念珠菌感染的傳染源，明確傳播途徑，防止爆發(fā)流行，確定同一患者反復(fù)感染是源于復(fù)發(fā)或再感染等研究，并表現(xiàn)出簡(jiǎn)易、快速、可靠，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)〔4〕。運(yùn)用CA-INT引物PCR法是進(jìn)行白色念珠菌基因分型的方法之一，CA-INT引物是針對(duì)白色念珠菌的可換位基因內(nèi)區(qū)（CA25SRRN）設(shè)計(jì)的特異引物，在白色念珠菌25S rDNA的CA25SRRN插入一個(gè)大小為379 bp的基因，即可擴(kuò)增出840 bp片段（B組），沒(méi)有插入該基因則擴(kuò)增450 bp片段（A組），兩種片段都有則擴(kuò)增840 bp片段和450 bp片段（C組），后者可能是真菌有性生殖的結(jié)果，此方法設(shè)計(jì)科學(xué)合理、簡(jiǎn)便快速、結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠，適合臨床推廣應(yīng)用〔3，5〕。本文采用CA-INT PCR基因分型方法，對(duì)54株HIV感染人群和54株健康人群口腔白色念珠菌進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)2組人群口腔白色念珠菌均可擴(kuò)增出清晰而穩(wěn)定的條帶，均具有A、B和C型，均以A型最多見，B型次之，C型最少，3種基因型的分布情況與文獻(xiàn)〔6-7〕報(bào)道一致。本研究結(jié)果顯示HIV感染人群口腔白色念珠菌A型所占構(gòu)成比要高于健康人群，其原因可能由于HIV感染人群口腔與健康人群口腔局部微生態(tài)環(huán)境不同，影響了白色念珠菌的寄生環(huán)境而致寄生菌株發(fā)生差異，確切的原因有待進(jìn)一步研究。武有聰〔2〕等采用隨機(jī)引物P2-RAPD方法對(duì)同一組HIV感染人群的口腔白色念珠菌進(jìn)行基因型研究，將其分為11個(gè)基因型，而本研究采用特異性INT引物法將這些白色念珠菌分成3個(gè)基因型，可見隨機(jī)引物RAPD法分辨率高于特異性INT引物法，但特異性INT引物分型法所擴(kuò)增的白色念珠菌基因條帶清晰而穩(wěn)定，檢測(cè)成功率為100%，故認(rèn)為CA-INT引物PCR法結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠、直觀。因此，特異性CA-INT引物PCR法是較好的白色念珠菌種內(nèi)菌株間鑒定的方法，可用于白色念珠菌基因型與表型關(guān)系研究，對(duì)確定口腔念珠菌病的復(fù)發(fā)和再感染及其分子流行病學(xué)研究均具有重要意義。

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rDNA Genotyping of Oral Candida albicans Isolated from HIV-infected Population

ZHANG Yuncao，LIU Qi,WU Youcong，GUO Lijun，SHEN Yuanying，BAI Li*
（School of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the distribution of genotypes of oral Candida albicans isolated from HIV-related group and healthy carriers group.Methods:PCR with CA-INT primers was designed to amplify group 1 intron-containing region in 25S rDNA of oral Candida albicans,the different strains of oral Candida albicans were classified into genotypes on the basis of bands from amplicons.Then the genotypic distribution results of all oral Candida albicans were analyzed with SPSS 17.0 by chi-square test. Results:One hundred and eight strains of oral cavities Candida albicans were classified into genotype A,B and C.Genotype A was the most predominant one.Identical genotypes distribution appeared in both groups.But the constituent ratio of genotype A of oral Candida albicans strains in HIV-positive group was statistically higher compared to the healthy people group.Conclusion:Genotypes of oral Candida albicans in both groups were highly polymorphic.The method in text is suitable to apply in genotyping research of oral Candida albicans.

Candida albicans;HIV;PCR;rDNA genotyping

R378.99［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］1672-2345（2011）08-0024-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C30260005）；大理學(xué)院高層次人才基金資助項(xiàng)目（KY430440）

2011-06-09

張?jiān)撇?，碩士研究生，主要從事病原生物學(xué)研究.

*通信作者：白麗，教授.

（責(zé)任編輯 董 杰）