張 靜，李永萍，張榮生，李雪梅

（大理學院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

惡性實體瘤患者自體CIK細胞的體外大量擴增后的免疫表型變化

張 靜，李永萍，張榮生，李雪梅

（大理學院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

目的：回顧性分析我院2009年1月至2010年5月行細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK）治療的59例實體瘤患者的自體CIK細胞體外擴增后免疫表型的變化，為惡性實體瘤患者開展CIK細胞治療提供實驗依據(jù)。方法：采集59例惡性實體瘤患者外周血單個核細胞，培養(yǎng)體系加入IFN-γ、CD3McAb及IL-2三種細胞因子體外誘導，培養(yǎng)10～14 d；用流式細胞儀分別檢測CIK細胞培養(yǎng)前后的免疫表型，進行配對t檢驗。結(jié)果：CIK細胞培養(yǎng)后單個核細胞，CD3+細胞，CD3+CD4+細胞，CD3-CD56+細胞，CD3+CD56+細胞均較培養(yǎng)前增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD3+CD8+細胞，雖然較前增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CIK細胞中CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3-CD56+表型的細胞比率與培養(yǎng)前相比均有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但CD3+CD8+細胞比率與培養(yǎng)前差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而CIK細胞的純度從培養(yǎng)前（9.90±8.96）%增至（46.55± 19.25%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：惡性實體瘤患者自體CIK細胞體外擴增后，CIK細胞純度顯著增加。

惡性實體瘤；CIK細胞；免疫表型

細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine-induced killer，CIK）是人外周血單個核細胞在體外經(jīng)抗CD3單克隆抗體、干擾素γ（IFN-r）、白細胞介素L-2，重組白細胞介素-2（rhIL-2）等多種細胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細胞，其具有“增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對多重耐藥腫瘤敏感、不受免疫抑制劑的影響、對正常骨髓造血毒性小”等優(yōu)勢〔1〕，目前在臨床上廣泛用于腫瘤的過繼免疫治療。我院從2009年11月開始開展CIK細胞治療腫瘤。本文就我院2009年11月至2010年5月行CIK治療的59例術(shù)后和晚期實體瘤患者的自體CIK細胞擴增后免疫表型的變化進行總結(jié)，以期為惡性實體瘤患者開展CIK細胞治療提供更完整的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 行CIK治療的實體瘤患者59例。分別為肝癌14例，甲狀腺癌3例，腎癌1例，肺癌11例，胃癌4例，結(jié)直腸癌14例，食道癌2例，膽囊癌1例，胰腺癌1例，乳腺癌1例，宮頸癌1例，甲狀腺癌3例，纖維肉瘤1例，惡性黑色素瘤1例，腦膠質(zhì)瘤1例。

1.2 CIK細胞擴增〔2〕根據(jù)文獻〔2〕方法，略作調(diào)整。血細胞分離機封閉式管道采集單個核細胞，無血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)為1×106個/mL，第1天加入IFN-γ（1 000 U/mL），培養(yǎng)24 h后加入rhIL-2（300 U/mL），CD3單抗（75 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)，每隔4 d更換培養(yǎng)基，調(diào)整細胞數(shù)為1×106個/ mL，補加rhIL-2（300 U/mL），每8 h在補加rhIL-2的同時補加CD3單抗（350 ng/mL），10～14 d開始收集CIK細胞。

1.3 免疫表型鑒定 調(diào)節(jié)PBMC或CIK細胞濃度為5×105/L，加入異硫氰酸熒光素標記單克隆抗體（抗CD3，CD4，CD8，CD56）上流式細胞儀檢測。

表1 CIK細胞培養(yǎng)前后細胞數(shù)量的變化（±s）

表1 CIK細胞培養(yǎng)前后細胞數(shù)量的變化（±s）

細胞表型PBMC CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3-CD56+ CD3+CD56+培養(yǎng)前（/×106/L）304.8±400.52 214.7±311.75 112.78±162.06 90.86±140.13 62.78±70.11 32.83±55.5培養(yǎng)后（/×106/L）1315.39±1672.60 518.92±560.77 179.75±224.94 778.47±3708.27 117.17±180.74 550.18±580.19 t值P -5.11 -5.48 -3.25 -1.42 -2.65 -7.01 0.00 0.00 0.00 0.16 0.01 0.00

表2 CIK細胞培養(yǎng)前后免疫表型變化（±s）

表2 CIK細胞培養(yǎng)前后免疫表型變化（±s）

細胞表型CD3+（T細胞）CD3+CD4+（Th細胞）CD3+CD8+（Ts細胞）CD3-CD56+（NK細胞）CD3+CD56+（CIK細胞）培養(yǎng)前/% 64.72±10.41 34.36±7.40 26.05±8.62 22.52±9.08 9.90±8.96培養(yǎng)后/% 47.21±21.80 16.78±10.71 25.95±13.81 9.20±5.63 46.55±19.25 t值P 6.06 12.79 0.06 11.27 -15.26 0.00 0.00 0.95 0.00 0.00

2 結(jié)果

2.1 CIK細胞擴增 由表1可見經(jīng)10～14 d培養(yǎng)后單個核細胞，CD3+細胞，CD3+CD4+細胞，CD3-CD56+細胞，CD3+CD56+細胞均較培養(yǎng)前增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD3+CD8+細胞，雖然較培養(yǎng)前擴增，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.16）。

2.2 CIK細胞免疫表型變化 比較單個核細胞（PBMC）和自體CIK細胞免疫表型（見表2），可見CIK細胞中CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3-CD56+表型的細胞與培養(yǎng)前相比均有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但CD3+CD8+細胞與培養(yǎng)前差異無統(tǒng)計學意義（P=0.95）。而CIK細胞的純度從培養(yǎng)前（9.90±8.96）%增至（46.55±19.25）%（CIK細胞的純度指流式細胞分析時CD3+CD56+細胞所占的百分數(shù)），差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

過繼性免疫治療是腫瘤生物治療的一種，在腫瘤綜合治療中有很重要的作用。繼淋巴因子激活殺傷細胞（LAK）、浸潤腫瘤淋巴細胞（TIL）及CD3單抗激活的殺傷細胞（CD3AK）后，1991年，斯坦福大學的Schmidt-Wolf〔1〕等首先報道了一類由多種細胞因子誘導的殺傷細胞，即細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）。CIK細胞能大量地擴增，比LAK細胞具有更強的腫瘤殺傷活性，CIK細胞的殺瘤作用日益受到重視。

目前認為CD3+CD56+細胞是CIK細胞中的主要效應細胞，CD3+CD56+細胞的增加預示CIK細胞抗腫瘤能力增強〔3〕。潘春華等〔4〕報道經(jīng)IFN-γ、CD3McAb及IL-2三種細胞因子體外誘導健康人單個核細胞培養(yǎng)20 d，CIK細胞的純度為（36.36± 4.6）%；張國慶等〔5〕觀察了23例惡性腫瘤患者外周血單個核細胞在體外經(jīng)擴增后，CIK細胞的純度由擴增前的（3.77±1.92）%增加到擴增后的（33.67± 18.04）%。國內(nèi)有學者〔6-7〕觀察細胞培養(yǎng)時間與CIK細胞表達的關(guān)系，結(jié)果顯示，在14～21 d呈高表達的平臺期。提示此期間CIK細胞具有較強的抗腫瘤能力，進行臨床應用可取得較好的療效。本研究進一步表明：惡性實體瘤患者自體CIK細胞經(jīng)IFN-γ、CD3McAb及IL-2三種細胞因子體外誘導，培養(yǎng)10～14 d，細胞數(shù)量明顯增多，CIK細胞的純度顯著增加。這與其他學者的報道基本一致。

〔1〕Schmidt-Wolf I G，Negrin R S，Kiem HP，et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity〔J〕.J Exp Med，1991，174（1）：139-149.

〔2〕朱建平，徐鳴，汝美華.CIK細胞臨床應用技術(shù)規(guī)范探討〔J〕.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2007，2（2）：148-150.

〔3〕Schmidt-Wolf I G，Lefterova P，Mehta B A，et al.Phenotypic characterization and identification of effector cells involved in tumor cell recognition of cytokine-induced killer cells〔J〕.Exp Hematol，1993，21（13）：1673-1679.

〔4〕潘春華，羅榮城.CIK細胞的表型分析及生物學活性研究〔J〕.解放軍醫(yī)學雜志，2003，28（11）：1030-1032.

〔5〕張國慶，焦順昌，林星石，等.惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞體外擴增后亞群的變化〔J〕.軍醫(yī)進修學院學報，2008，29（3）：184-186.

〔6〕康自珍，蔡海波，雷俊英，等.體外大量擴增CIK細胞的研究〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2002，18（5）：493-495.

〔7〕吳昌平，蔣敬庭，鄧海峰，等.CIK細胞體外培養(yǎng)的免疫表型〔J〕.江蘇醫(yī)藥，2005，31（9）：644-646.

Immunophenotype Changes of Auto-Cytokine Induced Killer Cells from Patients with Malignant Solid Tumor after Amplification in Vitro

ZHANG Jing,LI Yongping,ZHANG Rongsheng,LI Xuemei
（Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To retrospectively analyze the changes of immunophenotyping of auto-cytokine induced killer cells from 59 patients with malignant solid tumor after amplification from January 2009 to May 2010,and to provide experimental evidence to CIK therapy for malignant solid tumor patients.Methods:Peripheral blood mononuclear cells（PBMC）of 59 patients with malignant solid tumor were collected.PBMC were cultivated for 10-14 days in vitro with traditional cultivating system added IFN-γ,CD3McAb and IL-2.Then,immunophenotype changes of CIK cells before and after culture were measured with flow cytometry（FCM）.The results then were conducted with matched t test.Results:After cultured,the PBMC,CD3+cells,CD3+CD4+cells,CD3-CD56+cells, CD3+CD56+cells increased significantly compared with that of before（P＜0.05）.CD3+CD8+cells showed slight but not significant increase（P＞0.05）.The percentage of CD3+,CD3+CD4+,CD3-CD56+phenotype cells declined with statistical significance（P＜0.05）,while the percentage of CD3+CD8+cells had no significant difference（P＞0.05）.The purity of CIK cells after being cultured（46.55±19.25）%was significantly higher（9.90±8.96）%.Conclusion:The purity of CIK cells from patients with malignant solid tumor increased significantly after amplification in vitro.

cytokineInduced killer cells;malignant solid tumor;immunophenotype

R73-36+1［文獻標志碼］A［文章編號］1672-2345（2011）08-0039-02

2011-03-22

張靜，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤生物治療研究.

（責任編輯 張 煥）