楚金申，許 楊，何慶華，盧 江

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047)

化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

楚金申，許 楊*，何慶華，盧 江

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047)

應(yīng)用抗脫氧鐮刀菌烯醇單克隆抗體，以辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系，建立了一種簡便、快速、高特異性的間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法用于檢測谷物中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。所建立的方法分析靈敏度為10.7ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)小于8.1%，批間變異系數(shù)小于12.8%，玉米的加標(biāo)回收率為91.2%～99.5%，與其他常見真菌毒素未見明顯交叉，所建立的標(biāo)準曲線相關(guān)系數(shù)為0.9902，檢測線性范圍為12.9～163.7ng/mL，檢測時間為40min。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法(CLEIA)，檢測

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體腹水、DON人工抗原(DON-HG-BSA) 實驗室自制;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、伏馬菌素 B1(Fumonisins B1，F(xiàn)B1)、伏馬菌素B2(Fumonisins B2， FB2)、赭曲霉毒素 A(ochratoxin A，OTA)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxins B1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、羊抗鼠IgG-HRP Sigma;辣根過氧化物酶(HRP)(RZ＞3) 上海生工;化學(xué)發(fā)光底物液Pierce公司(USA);檢測DON的ELISA試劑盒 南昌博恒。

化學(xué)發(fā)光檢測儀 Thermo公司(USA);96孔化學(xué)發(fā)光板條 購自深圳金燦華有限公司;酶標(biāo)儀Thermo公司(USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 間接競爭酶聯(lián)免疫分析法(ELISA) 用0.05mol/mL磷酸緩沖液稀釋抗原至1.5μg/mL，向微孔板中每孔加100μL，4℃包被12h，PBST洗滌液洗3次，每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶)，37℃封閉1h后，甩去封閉液洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔中分別加入系列稀釋的DON標(biāo)準品(0、10、20、50、100、200、400ng/mL)或樣品 50μL，同時加入1∶60000倍稀釋的抗體溶液50μL，混勻，37℃溫育30min，洗滌4次，加入1∶2000稀釋的羊抗鼠IgGHRP，100μL/孔，37℃溫育30min，洗滌4次，拍干，加100 μL TMB顯色液，顯色反應(yīng)5min后加2mol/L硫酸50μL終止反應(yīng)，并于 450nm處檢測吸光度(OD450nm)。

1.2.2 間接競爭化學(xué)發(fā)光免疫法(CLEIA) 用0.05mol/mL磷酸緩沖液稀釋抗原至1.0μg/mL，向微孔板中每孔加100μL，4℃包被12h，然后用PBST洗滌液洗3次，每孔加300μL封閉液(5%的脫脂牛奶)，37℃封閉1h后，甩棄封閉液洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔中加入系列稀釋的DON標(biāo)準品(0、5、10、20、50、100、200ng/mL)或樣品50μL，同時加入1∶10000倍稀釋的抗體溶液50μL，混勻，37℃溫育10min，洗滌4次，加入1∶1000稀釋的羊抗鼠IgGHRP，100μL/孔，37℃溫育30min，洗滌4次，拍干，每孔加發(fā)光底物液100μL，用化學(xué)發(fā)光檢測儀測量相對發(fā)光強度單位(relative light units，RLU)。

1.2.3 檢測條件的確定 采用方陣滴定［10］確定ELISA抗原和抗體反應(yīng)的工作濃度。據(jù)文獻表明［11］，RLUmax/IC50越大，CLEIA的靈敏度和重復(fù)性越好，因此引入RLUmax/IC50評價各種因素的影響。按照1.2.2操作步驟分別對包被濃度、抗體工作濃度和競爭反應(yīng)時間、羊抗鼠IgG-HRP的工作濃度和孵育時間優(yōu)化。

1.2.4 方法學(xué)分析 a.標(biāo)準曲線:準確稱取4.0mg DON標(biāo)準品溶于1mL蒸餾水中，配制成4mg/mL DON標(biāo)準品母液，將DON標(biāo)準品母液分別稀釋至終濃度為5、10、20、50、100、200、400ng/mL，參照文獻［11］建立CLEIA標(biāo)準曲線。

b.靈敏度:對零標(biāo)準點平行測定10次，計算相對發(fā)光強度的平均值及其標(biāo)準偏差，再由平均值減去兩倍標(biāo)準偏差得出的值代入校準曲線所求得的濃度即是靈敏度，重復(fù)實驗3次，計算平均靈敏度。

1.動手實踐。學(xué)生是課堂的主體。“眼過千變不如手過一遍”，書本中的知識是研究者留下的精華，然而要真正理解這些知識，還需為學(xué)生創(chuàng)造更多的動手機會，親自探索知識背后的奧秘。例如，在探究求“平行四邊形面積方法”時，老師為學(xué)生準備了不同材料，引導(dǎo)學(xué)生將這些平行四邊形進行分拆和轉(zhuǎn)變，平行四邊形可拆成兩個三角形，也可成為三角形和長方形結(jié)合，或也可以轉(zhuǎn)化成兩個梯形……不同的學(xué)生會從不同的角度思考問題，結(jié)果也就多樣化，這種多樣化的知識引導(dǎo)，讓學(xué)生思考的角度也變的新穎。

c.批內(nèi)批間變異:隨機抽取板條分別進行3個批次的包被，每批次6個平行進行測定，分別計算IC50的批內(nèi)及批間變異。

d.回收率:在玉米樣品中分別添加 50、100、150μg/kg的DON標(biāo)準品，依照1.2.5進行樣品提取，分別用ELISA試劑盒和CLEIA檢測樣品濃度。

e.特異性:選取五種常見的真菌毒素:黃曲霉毒素B1(AFB1)、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)，采用CLEIA方法測定了與DON的交叉反應(yīng)。

1.2.5 樣品提取 稱取5g粉碎樣品置于100mL具塞三角瓶內(nèi)，準確加入25mL超純水。將加入水的樣品放入振蕩器內(nèi)，充分振蕩3min后，用定性濾紙過濾，取濾液4mL，加入4mL超純水，混勻，用定性濾紙過濾，濾液為樣品待檢液。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析法的建立

2.1.1 抗原包被濃度的選擇 采用檸檬酸緩沖液分別稀釋抗原至0.25、0.5、1.0、2.0μg/mL，其他步驟參照1.2.2。結(jié)果如圖2所示，由圖2可見，IC50隨著抗原包被濃度的增大先減小然后增大，RLUmax/IC50隨著抗原濃度的增大先增大然后減小，在抗原濃度為1.0μg/mL時達到最大，因此選用1.0μg/mL作為抗原包被濃度。

圖2 CLEIA抗原包被濃度的優(yōu)化

圖3 CLEIA抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

2.1.3 競爭反應(yīng)時間的選擇 按照1.2.2操作步驟分別選擇競爭反應(yīng)時間為5、10、15、20、25min進行實驗，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，隨著競爭時間的延長，IC50呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，RLUmax/IC50在10min時達到最大，選定10min作為競爭反應(yīng)時間。

2.1.4 羊抗鼠IgG-HRP孵育時間的確定 按照1.2.2操作步驟分別選擇羊抗鼠IgG-HRP孵育時間為25、30、35、40、45min進行實驗。實驗結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，隨著孵育時間的增長，IC50先減小然后增大，RLUmax/IC50先增大然后減小，在30min時達到最大，選定30min作為孵育時間。

圖4 CLEIA競爭反應(yīng)時間的優(yōu)化

圖5 CLEIA羊抗鼠IgG-HRP孵育時間的優(yōu)化

2.1.5 羊抗鼠IgG-HRP工作濃度的確定 用磷酸緩沖液將抗體分別稀釋1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000稀釋羊抗鼠IgG-HRP，其他步驟參照1.2.2。實驗結(jié)果如圖6、表1所示。由圖6可見，隨著羊抗鼠IgG-HRP稀釋倍數(shù)的增大，RLUmax/IC50逐漸減小，但從表1中可以看出若羊抗鼠IgG-HRP稀釋倍數(shù)過小，發(fā)光本底會急劇增大，因此選定1∶1000作為羊抗鼠IgG-HRP工作濃度。

表1 羊抗鼠IgG-HRP稀釋倍數(shù)對發(fā)光本底的影響

圖6 CLEIA羊抗鼠IgG-HRP工作濃度的優(yōu)化

2.1.6 發(fā)光底物液量的確定 按照1.2.2操作步驟，最后每孔分別加入化學(xué)發(fā)光底物液70、100、130、160μL用化學(xué)發(fā)光儀進行測定。結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，當(dāng)每孔加入130μL進行測定時，IC50最小，RLUmax/IC50最大，選定化學(xué)發(fā)光底物液加入量為130μL。

2.2 方法學(xué)評價

2.2.1 標(biāo)準曲線 按照1.2.4繪制CLEIA標(biāo)準曲線見圖8。線性回歸方程為Y=-23.6Ln(X)+140.5 (R2=0.9902)，IC50=46.01g/mL，檢測范圍(IC20～IC80)為12.9～163.7ng/mL。

圖7 化學(xué)發(fā)光底物加入量的優(yōu)化

圖8 CLEIA的標(biāo)準曲線

2.2.2 靈敏度和精密度 按照1.2.4計算得CLEIA平均靈敏度為10.7ng/mL，較ELISA試劑盒的靈敏度30.8ng/mL(IC85)提高了2.88倍。

按照1.2.4分別計算IC50的批內(nèi)及批間變異，結(jié)果見表2。

表2 CLEIA對DON測定的精密度

2.2.3 回收率 按照1.2.4回收率檢測結(jié)果見表3，由表3可知，CLEIA的加標(biāo)回收率在91.2%以上。

表3 CLEIA對DON測定的加標(biāo)回收率

2.2.4 特異性 選取五種常見的真菌毒素:黃曲霉毒素B1(AFB1)、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)，采用CLEIA方法測定了與DON的交叉反應(yīng)率，結(jié)果見圖9，未見有交叉反應(yīng)。

圖9 CLEIA常見真菌毒素的交叉反應(yīng)

2.3 CLEIA樣品測定與ELISA試劑盒的比較

分別采用CLEIA和 ELISA試劑盒測定了在南昌市場上隨機購買的40份玉米樣品，兩種方法的所測結(jié)果見表4，以CLEIA的測定值為X軸，ELISA試劑盒測定值為Y軸，作圖得相關(guān)曲線，如圖10所示，線性擬合的方程為 Y=1.012X-53.46，相關(guān)系數(shù)為0.934。

表4 CLEIA和ELISA試劑盒的樣品測定結(jié)果(μg/kg)

圖10 CLEIA的測定值與ELISA測定值的相關(guān)性

3 結(jié)論

3.1 采用HRP催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系，優(yōu)化并確定了化學(xué)發(fā)光酶免疫反應(yīng)的條件為:稀釋抗原至1.0μg/mL，4℃孵育包被12h，1∶10000稀釋DON抗體競爭反應(yīng) 10min，1∶1000稀釋羊抗鼠IgG-HRP孵育反應(yīng)30min后每孔加入130μL化學(xué)發(fā)光底物液。

3.2 建立了一種測定玉米中DON化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，方法分析靈敏度為10.7ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)小于8.1%，批間變異系數(shù)小于12.8%，以玉米為樣品的分析回收率為91.2%～99.5%，與其他常見真菌毒素未見明顯交叉，所建立的標(biāo)準曲線相關(guān)系數(shù)為0.9902，檢測線性范圍為12.9～163.7ng/mL，樣品檢測時間為40min。

3.3 建立的CLEIA與ELISA相比靈敏度提高了2.88倍。采用CLEIA和ELISA試劑盒測定了40份市場樣品，并進行了對照，兩者的線性相關(guān)系數(shù)為0.934。

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Chemiluminescence enzyme immunoassay for the determination of deoxynivalenol in corn

CHU Jin-shen，XU Yang*，HE Qing-hua，LU Jiang
(Sino-Germany Joint Research Institute，The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

A sensitive indirect competitive chemiluminescence’s enzyme immunoassay(CLEIA)for deoxynivalenol in corn was developed.The optimized CLEIA gave a limit detection of 10.7ng/mL and a detection range of 12.9～163.7ng/mL，with an IC50of 46.01ng/mL and it was about 4.01 times more sensitive than that of colorimetric ELISA. It had been validated on cereals samples in terms of precision(intra-and interassay coefficient variations of less than 8.1%and 12.8%，respectively)and accuracy(mean recovery 91.2%～99.5%).These assay performances indicated that CLEIA was capable of being applied for the specific detection and routine monitoring of DON in corn samples.

deoxynivanol;CLEIA;detection

TS207.3

A

1002-0306(2011)09-0407-04

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivanol，DON)，是一種單端孢霉烯族真菌毒素，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，污染玉米、小麥和大麥等谷物及其制品［1］，具有免疫毒性、胚胎毒性和細胞毒性等［2-3］，所有的動物都會對DON有不同程度的過敏反應(yīng)，其中豬的反應(yīng)最為強烈［4］。我國規(guī)定谷物及其制品中DON的限量標(biāo)準為1mg/kg(1000ng/kg)［5］。目前常用的檢測DON的方法主要有高效液相色譜(HPLC)法［6］、氣相色譜法(GC/MS)［7］和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［8］等。前兩種方法靈敏、準確，但耗時，費力，成本高且需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的人員操作;酶聯(lián)免疫吸附法快速、特異性好，但靈敏度不夠高。間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法既具有放射免疫法的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫法操作簡便、快速的特點，線性范圍寬、測試中無需使用對人體有害的試劑［9］。本研究采用魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系建立了檢測玉米種DON的間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫法(CLEIA)。該方法靈敏度高、特異性好、簡單快速。

2010-09-14 *通訊聯(lián)系人

楚金申(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:工業(yè)微生物。

“國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃”項目資助(2007AA10Z427)。