姚 雪，羅學(xué)剛，韓本超

(西南科技大學(xué)植物學(xué)系，四川綿陽(yáng)621010)

魔芋葡甘聚糖酶解過(guò)程及各種不同分子量葡甘露低聚糖制備條件的研究

姚 雪，羅學(xué)剛*，韓本超

(西南科技大學(xué)植物學(xué)系，四川綿陽(yáng)621010)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)研究β-甘露聚糖酶在催化降解魔芋葡甘聚糖的過(guò)程中酶液濃度、緩沖液pH、溫度、底物濃度以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分子量分布的影響，同時(shí)得到各種不同分子量范圍葡甘聚糖降解產(chǎn)物的制備條件。結(jié)果表明:在降解過(guò)程中，各因素對(duì)降解產(chǎn)物分子量的影響大小依次為酶液濃度＞底物濃度＞pH＞溫度＞時(shí)間，對(duì)分散系數(shù)D值的影響大小依次為酶液濃度＞溫度＞pH＞底物濃度＞時(shí)間。

葡甘聚糖，β-甘露聚糖酶，數(shù)均分子量，分散系數(shù)，凝膠色譜

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魔芋精粉 四川綿陽(yáng)安縣都樂(lè)魔芋制品有限公司;β-甘露聚糖酶 四川禾本生物工程有限公司，酶活力≥3291u/g;氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、檸檬酸鈉 成都科隆化工試劑有限公司，均為分析純。

1100/1200高效液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)Agilent公司;NICOLET 6700型傅立葉變換紅外吸收光譜儀美國(guó)賽默飛世爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-甘露聚糖酶催化葡甘聚糖降解反應(yīng) 本研究中，不同濃度酶液的制備方法為:準(zhǔn)確稱取1.0000g β-甘露聚糖酶，定容至100mL，得到酶液Ⅰ;取酶液Ⅰ10mL定容至100mL，得到酶液Ⅱ;取酶液Ⅱ中10mL定容到100mL，得到酶液Ⅲ;取酶液Ⅲ中10mL定容到100mL，得到酶液Ⅳ;取酶液Ⅳ中10mL定容到100mL，得到酶液Ⅴ;取酶液Ⅴ中10mL定容到100mL，得到酶液Ⅵ;取酶液Ⅵ中 10mL定容到100mL，得到酶液Ⅶ;以上配制好的酶液在使用時(shí)均取1mL，由于濃度相差較大，為方便標(biāo)記，文中以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ來(lái)分別代表1mL上述不同濃度的酶液。將酶液置于4℃環(huán)境保存，2d內(nèi)用完。

本研究中pH為3.5、4.5和5.5的緩沖液由檸檬酸-檸檬酸鈉體系組成;pH為6.5、7.5和8.5的緩沖液由磷酸氫二鉀-氫氧化鈉體系組成。

在β-甘露聚糖酶催化葡甘聚糖的降解反應(yīng)中，主要考察不同酶液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ)的濃度、緩沖液pH(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)、酶解溫度(14、26、38、50、62℃)、底物濃度(0.05%、0.65%、1.25%、1.85%、2.45%、3.05%)和反應(yīng)時(shí)間(2.5、5、10、20、30、40、50、60min)這五個(gè)單因素對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分子量分布的影響。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定因素水平范圍，以降解產(chǎn)物的數(shù)均分子量和分子量分散系數(shù)D值為考察指標(biāo)，進(jìn)行L18(37)正交實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步分析酶解過(guò)程中各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響程度。

酶解方法:將配制好的不同濃度的新鮮酶液1mL加入到99mL不同pH的緩沖溶液中，于不同溫度下在集熱式恒溫加熱攪拌器中保溫10min;磁力攪拌作用下加入一定量已烘干至恒重的魔芋精粉，于不同的溫度下準(zhǔn)確酶解一段時(shí)間，取出，煮沸滅酶10min。

1.2.2 降解產(chǎn)物分子量及分子量分布測(cè)定 測(cè)試方法:采用凝膠滲透色譜法測(cè)定。儀器:美國(guó)Agilent公司的1100/1200高效液相色譜系統(tǒng);色譜柱:PL aquagel-OH MIXED 8μm，300×7.5mm，貨號(hào)為5064 -5282;標(biāo)準(zhǔn)品:PEO/PEG，貨號(hào)為5064-5280;檢測(cè)器:G1362A示差折光檢測(cè)器(RID)。測(cè)試條件:流動(dòng)相為娃哈哈純凈水配制的1‰的疊氮化鈉溶液;流速為1mL/min;柱溫為35℃;進(jìn)樣量為20μL;進(jìn)樣時(shí)間為20min。

1.2.3 降解產(chǎn)物紅外光譜分析 將制備的降解產(chǎn)物用無(wú)水乙醇沉淀，4000r/min離心20min，收集白色沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥。采用NICOLET 6700型傅立葉變換紅外吸收光譜儀對(duì)干燥后的產(chǎn)物在650～ 4000cm-1范圍做傅立葉衰減全反射測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶液濃度對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

在反應(yīng)溫度50℃，緩沖液pH 7.5，反應(yīng)時(shí)間為20min，底物濃度為1.25%的條件下，酶濃度對(duì)降解產(chǎn)物分子量的影響如圖1所示。從圖1中可以看出，當(dāng)其它條件一致時(shí)，隨著酶濃度的增加，降解產(chǎn)物的分子量也呈遞減的趨勢(shì)，在酶濃度過(guò)大時(shí)，如Ⅰ和Ⅱ，分子量的降低不明顯，在酶濃度過(guò)小時(shí)，如Ⅵ和Ⅶ，分子量的降低也不明顯。正交實(shí)驗(yàn)時(shí)選取酶濃度水平為酶液Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ酶濃度。

圖1 酶濃度對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

隨著酶濃度的增加，分散系數(shù)呈上升趨勢(shì)(A-B階段)，達(dá)到一個(gè)最大值后又有輕微的下降趨勢(shì)(B-C階段)。魔芋葡甘聚糖的酶解主要是一個(gè)多次剪切過(guò)程［15］，即酶分子分布在部分葡甘聚糖分子鏈上，而其它分子鏈只有等酶脫附之后才能進(jìn)行水解，這就造成了降解產(chǎn)物中始終存在著分子量幾乎沒(méi)有發(fā)生變化的大分子鏈，同時(shí)也存在已被多次剪切的小分子鏈，這也造成了分散系數(shù)D值較大的可能性。在A-B階段，當(dāng)酶濃度逐漸增大時(shí)，剪切的分子鏈和次數(shù)便隨著增大，由原來(lái)全是大分子鏈的體系逐漸開(kāi)始出現(xiàn)小分子鏈，并且隨酶濃度的增加，小分子鏈出現(xiàn)的概率越大，于是D值便開(kāi)始增大;在B-C階段，酶濃度增大到一定值時(shí)，被剪切的分子鏈越來(lái)越多，當(dāng)小分子鏈的數(shù)量大大超過(guò)大分子鏈的數(shù)量時(shí)，體系開(kāi)始以小分子鏈為主，分散系數(shù)D值又開(kāi)始有所下降。

2.2 緩沖液的pH對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

在反應(yīng)溫度50℃，酶濃度為Ⅳ，反應(yīng)時(shí)間為20min，底物濃度為1.25%的條件下，緩沖液pH對(duì)降解產(chǎn)物分子量的影響如圖2所示。從圖2中可以看出，當(dāng)其它條件一定，pH由3.5增加到7.5時(shí)，分子量曲線逐漸下降，在pH為7.5左右下降至最低點(diǎn)，此時(shí)，隨著pH的增加，分子量又開(kāi)始上升，即pH 7.5是酶的最適條件，此時(shí)酶活力達(dá)到最大。正交實(shí)驗(yàn)時(shí)選取pH的水平為3.5、5.5和7.5。

隨緩沖液pH的增大，分散系數(shù)D值有所增加，在pH為3.5到5.5之間時(shí)，可能由于酶活性較低，對(duì)降解反應(yīng)沒(méi)有起到多大的作用，大部分分子鏈未得到剪切，所以分散系數(shù)較小;隨著pH越來(lái)越接近酶的最適pH，酶活性增加，降解作用也更加強(qiáng)烈，體系中越來(lái)越多的分子鏈遭到了酶分子的剪切，于是分子量小的分子鏈開(kāi)始大量出現(xiàn)，分散系數(shù)也隨之增大。

圖2 pH對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

2.3 溫度對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

在酶濃度為Ⅳ，緩沖液pH為7.5，反應(yīng)時(shí)間為20min，底物濃度為1.25%的條件下，溫度對(duì)酶解產(chǎn)物分子量的影響曲線如圖3所示。從圖3中可以看出，溫度從14℃升高至50℃時(shí)，曲線呈下降趨勢(shì)，在50℃時(shí)下降至最低點(diǎn)，之后隨溫度的增加，分子量又逐步升高，即酶的最適溫度為50℃。正交實(shí)驗(yàn)時(shí)選取溫度水平為26、38、50℃。

圖3 溫度對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

在14℃，酶活性很低，于是酶對(duì)魔芋分子鏈的剪切作用也相當(dāng)小，大部分的分子鏈未得到剪切，所以整個(gè)體系仍然以大分子鏈為主，分散系數(shù)比較小;隨著溫度的升高，到38℃，酶活力越來(lái)越大，剪切作用越來(lái)越強(qiáng)烈，體系中開(kāi)始出現(xiàn)大量小分子鏈時(shí)，分散系數(shù)便開(kāi)始增大;直到50℃(酶的最適溫度)，小分子鏈占據(jù)體系總體絕大多數(shù)時(shí)，分散系數(shù)開(kāi)始下降。另外一個(gè)重要原因是隨著溫度的升高，分子間的熱運(yùn)動(dòng)加快，導(dǎo)致酶的運(yùn)動(dòng)速度也增加，使酶與各個(gè)魔芋分子鏈之間接觸的機(jī)會(huì)均勻，這可能也是直到60℃，酶的活性已經(jīng)開(kāi)始降低，分子量又開(kāi)始增加，但分散系數(shù)仍然在下降的原因。

2.4 底物濃度對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

在反應(yīng)溫度50℃，酶濃度為Ⅳ，緩沖液的pH為7.5，反應(yīng)時(shí)間為20min的條件下，底物濃度對(duì)降解產(chǎn)物分子量的影響曲線如圖4所示。從圖1中可以看出，隨著底物濃度的增加，降解產(chǎn)物的分子量逐漸上升，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到2.45%左右時(shí)，分子量的上升不明顯，說(shuō)明此時(shí)底物濃度達(dá)到了飽和。正交實(shí)驗(yàn)時(shí)選取底物濃度水平為0.05%、1.25%和2.45%。

圖4 底物濃度對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

隨著底物濃度的增加，D值整體呈下降趨勢(shì)。當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.05%時(shí)，底物溶液此時(shí)處于稀溶液狀態(tài)，葡甘聚糖分子鏈線團(tuán)是處于孤立存在的，相距較遠(yuǎn)，相互之間沒(méi)有交疊，加上酶的多次剪切機(jī)制，于是酶在一條分子鏈上的剪切作用完成后由于熱運(yùn)動(dòng)到其它分子鏈上繼續(xù)進(jìn)行剪切，這樣使得體系中分子鏈的分子量有大有小，且比較極端，造成D值較大。底物濃度逐漸增大，溶液體系也經(jīng)歷著由稀溶液→亞濃溶液→濃溶液的過(guò)程，高分子鏈開(kāi)始發(fā)生接觸，擠壓在一起，進(jìn)而相互交疊和穿透，增大到一定程度，分子鏈的充分纏繞形成了各處鏈段分布大致均勻的纏結(jié)網(wǎng)［16］，使得酶在多次剪切作用后運(yùn)動(dòng)到另一條底物上的距離大大縮短，甚至酶分子可以通過(guò)底物分子鏈在相互接觸的纏結(jié)點(diǎn)處由一條分子鏈直接運(yùn)動(dòng)到另一條分子鏈上，使多次剪切的作用降低，分子量分布比較均勻，D值較小。

2.5 時(shí)間對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響

在反應(yīng)溫度50℃，酶濃度為Ⅳ，緩沖液的pH為7.5，底物濃度為1.25%的條件下，酶解時(shí)間對(duì)降解產(chǎn)物分子量的影響曲線如圖5所示。由圖5可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，降解產(chǎn)物的分子量呈下降趨勢(shì)。在前30min內(nèi)，下降趨勢(shì)較明顯。當(dāng)時(shí)間超過(guò)50min后，分子量的降低趨于平緩。從整體趨勢(shì)上看，整條曲線的變化幅度不大，因此可以斷定，時(shí)間對(duì)降解產(chǎn)物分子量的影響較小。同時(shí)也可以看出β-甘露聚糖酶的高效性，在很短的時(shí)間內(nèi)便達(dá)到催化降解的目的。正交實(shí)驗(yàn)時(shí)選取時(shí)間水平為5、20、40min。

圖5 時(shí)間對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)影響

從整體上看，曲線呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，分散系數(shù)越來(lái)越小。當(dāng)酶濃度、底物濃度、溫度和pH等條件合適時(shí)，酶是相當(dāng)高效的，在很短的時(shí)間內(nèi)，便將分子量降低到30萬(wàn)以下，但是由于多次剪切的原因，分子量的大幅度降低是由部分分子鏈的過(guò)度剪切造成的，而此時(shí)體系中仍然存在較多的大分子鏈，它們甚至還沒(méi)有得到剪切;之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶脫離一個(gè)個(gè)已經(jīng)被剪切的小分子鏈，進(jìn)而轉(zhuǎn)向更多的未被剪切的大分子鏈，使得整個(gè)體系逐漸全部向小分子鏈轉(zhuǎn)變，于是分散系數(shù)便隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶濃度、緩沖液pH、反應(yīng)溫度、底物濃度和時(shí)間五個(gè)因素，采用數(shù)均分子量(Mn)及分子量分散系數(shù)(D值)作為評(píng)價(jià)酶解體系的指標(biāo)，選用L18(37)［17］正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)酶解反應(yīng)過(guò)程做進(jìn)一步評(píng)價(jià)，目的在于考察各因素對(duì)葡甘聚糖降解產(chǎn)物分子量及分散系數(shù)的影響程度。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表3 正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果(完全隨機(jī)模型)

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)方程分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

據(jù)軟件分析的結(jié)果可知，在β-甘露聚糖酶催化降解KGM的過(guò)程中，各因子對(duì)降解產(chǎn)物數(shù)均分子量大小的影響順序是:A＞D＞B＞C＞E，即酶液濃度＞底物濃度＞pH＞溫度＞時(shí)間。其中，酶液濃度的影響在極顯著水平，底物濃度的影響在顯著水平，時(shí)間對(duì)降解反應(yīng)的影響較小。

據(jù)軟件分析的結(jié)果可知，在β-甘露聚糖酶催化降解KGM的過(guò)程中，各因子對(duì)分散系數(shù)D值的影響順序是:A＞C＞B＞D＞E，即酶濃度＞溫度＞pH＞底物濃度＞時(shí)間。此外，各因素對(duì)降解產(chǎn)物的分散系數(shù)D值均不顯著。

2.7 降解產(chǎn)物紅外分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)降解產(chǎn)物的紅外光譜分析可知，所有通過(guò)β-甘露聚糖酶降解得到的魔芋葡甘聚糖產(chǎn)物與未降解的魔芋葡甘聚糖具有相同的結(jié)構(gòu)特征。由于樣品較多，圖6展示的是隨機(jī)選取的幾個(gè)測(cè)定結(jié)果(第4、10、18號(hào)處理)的紅外光譜圖。從圖6中可以看出，分子量不同的葡甘聚糖的紅外圖譜基本相同，且與沒(méi)有經(jīng)過(guò)酶解的葡甘聚糖的圖譜也相同。其中，3378cm-1是O-H的伸縮振動(dòng)峰，這是多糖類化合物的一個(gè)特征吸收峰;2904cm-1是亞甲基的碳?xì)渖炜s振動(dòng)峰;1732cm-1是表征葡甘聚糖乙?；嬖诘聂驶炜s振動(dòng)峰;874cm-1處是表征β-D糖苷鍵構(gòu)型的吸收峰;808cm-1處是吡喃環(huán)呼吸振動(dòng)峰特征吸收峰。

圖6 不同分子量魔芋葡甘聚糖紅外光譜分析圖注:1-未降解KGM;2-4號(hào);3-10號(hào);4-18號(hào)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了酶濃度、緩沖液pH、溫度、底物濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)β-甘露聚糖酶催化降解魔芋葡甘聚糖的過(guò)程，具體分析了以上因素對(duì)降解產(chǎn)物的分子量及分子量分布的影響，并在單因素實(shí)驗(yàn)的篩選基礎(chǔ)上，采用L18(37)正交實(shí)驗(yàn)分析了上述因素對(duì)降解產(chǎn)物分子量及分子量分布的影響程度，得到了不同分子量葡甘聚糖降解產(chǎn)物的制備條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在β-甘露聚糖酶催化降解魔芋葡甘聚糖的過(guò)程中，各因子對(duì)降解產(chǎn)物數(shù)均分子量大小的影響次序依次是:酶液濃度＞底物濃度＞pH＞溫度＞時(shí)間;各因子對(duì)降解產(chǎn)物分散系數(shù)D值的影響次序依次是:酶液濃度＞溫度＞pH＞底物濃度＞時(shí)間;并且，紅外分析結(jié)果表明，各降解產(chǎn)物與未降解的KGM具有相同的結(jié)構(gòu)特征。本研究通過(guò)對(duì)酶解過(guò)程中各因素的控制而得到不同分子量的葡甘聚糖降解產(chǎn)物的制備條件，使葡甘聚糖的酶解過(guò)程達(dá)到了真正意義上的可控，為各種分子量范圍的魔芋葡甘露低聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)以及在生產(chǎn)中如何通過(guò)控制酶解條件降低降解產(chǎn)物分子量分散系數(shù)D值提供了理論基礎(chǔ)。

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Study on the enzyme-catalyzed degradation of konjac glucomannan and the preparation conditions on the degradation product of various molecular weights

YAO Xue，LUO Xue-gang*，HAN Ben-chao
(Department of Botany，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China)

To gain the preparation conditions of various molecular weight of KGM and research the influence of the enzyme concentration，pH，temperature，substrate concentration，reaction time on the degradation products molecular weight and molecular weight distribution，single factor experiment and orthogonal test were employed for investigating the degradation reaction of KGM catalyzed by β-mannanase.The results showed that effects of various factors on the molecular weight of degradation products were in the following descending order:enzyme concentration＞substrate concentration＞pH＞temperature＞time.Effects of various factors on the molecular weight distribution were in the following descending order:enzyme concentration＞temperature＞pH＞substrate concentration＞time.

konjac glucomannan;β-mannanase;number average molecular weight;dispersion coefficient; gel chromatography

TS201.2+3

A

1002-0306(2011)09-0097-05

魔芋是天南星科魔芋屬多年生草本植物，其主要活性成分葡甘聚糖(KGM)是一種水溶性的天然高分子多糖，可廣泛應(yīng)用于環(huán)保、食品、醫(yī)藥、化工以及生物領(lǐng)域［1-2］。KGM相對(duì)分子量為200000～2000000［2］，如此巨大的分子量也使KGM具有良好的凝膠性、增稠性、成膜性等多種特性［3］，但同時(shí)巨大的分子量使KGM在水中的粘度非常大，影響了KGM在水中的溶解度，限制了KGM的應(yīng)用范圍。在食品領(lǐng)域，KGM特殊的生理功能使它深受糖尿病、肥胖癥患者以及中老年消費(fèi)者的喜愛(ài)，但KGM巨大的分子量卻使它難消化、易阻塞，使人體產(chǎn)生腹脹、腹瀉等一些不適癥狀［4］，因而被人們視為“發(fā)物”，讓許多消費(fèi)者對(duì)其敬而遠(yuǎn)之。與KGM使用受限形成鮮明對(duì)比的是，近年來(lái)對(duì)葡甘露低聚糖的研究和應(yīng)用愈加廣泛，研究發(fā)現(xiàn)，魔芋葡甘露低聚糖具有促生雙歧桿菌［5］、吸附病原菌［6］、降脂［7］、清除自由基［8］、抑制腸內(nèi)氨的生成和吸收［9］等特殊功能。能夠?qū)崿F(xiàn)KGM的可控降解，得到各種不同分子量范圍的KGM產(chǎn)品，并且使降解后的KGM產(chǎn)物的分子量分散系數(shù)D值盡可能小，對(duì)魔芋資源的深度開(kāi)發(fā)利用和應(yīng)用范圍的推廣是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。目前，在葡甘聚糖的降解方面，幾乎全部是將葡甘聚糖直接降解成分子量極低的低聚糖(分子量通常在104以下)，沒(méi)有得到其它范圍的分子量分布的降解產(chǎn)物，未達(dá)到真正意義上的“可控降解”，本文的目的就是通過(guò)篩選和優(yōu)化各種控制降解產(chǎn)物分子量和分散系數(shù)的因素，制備出不同分子量的葡甘露低聚糖。

2010-10-15 *通訊聯(lián)系人

姚雪(1986-)，女，碩士研究生，研究方向:生物大分子的改性與利用。

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAE42B04)。