白會釵，張 于，江 波，沐萬孟，張 濤

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

熒光假單胞菌PSEUDOMONAS FLUORESCENCE SK17.001轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乳糖酸的條件研究

白會釵，張 于，江 波*，沐萬孟，張 濤

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

利用熒光假單胞菌SK17.001為出發(fā)菌株，轉(zhuǎn)化乳糖生產(chǎn)乳糖酸。通過研究發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分對乳糖轉(zhuǎn)化率影響，表明熒光假單胞菌SK17.001的最適合轉(zhuǎn)化條件為:培養(yǎng)溫度30℃，pH 6.5，250mL搖瓶中液體培養(yǎng)基裝液量為30mL，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，最佳氮源為1%蛋白胨和1%酵母膏，培養(yǎng)時間55h，乳糖濃度為3%時，轉(zhuǎn)化率可達96%。

乳糖酸，熒光假單胞菌，生物轉(zhuǎn)化

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

Pseudomonas fluroscence SK17.001 本實驗室從土壤中篩選獲得，并鑒定;乳糖 購自Fluka公司;其他試劑 市售，均為分析純;斜面培養(yǎng)基 PDA;種子培養(yǎng)基(g/L) 蔗糖30，氯化鉀0.5，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.2，硝酸鈉3，pH 6.2;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 乳糖30，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸氫二鉀2，硫酸鎂1;底物濃度(g/L)30。

光照恒溫培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，電子天平，722型分光光度計，HPLC。

1.2 培養(yǎng)方法

從斜面中取一定量熒光假單胞菌接種于種子培養(yǎng)基，28℃，200r/min，培養(yǎng)20h;從種子培養(yǎng)基接種至搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，接種量為6%，250mL搖瓶裝液量30mL，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，振蕩培養(yǎng)，檢測乳糖酸的含量。

1.3 菌體生長濃度測定

采用722型分光光度計，在600nm下，測定菌液的OD值。

1.4 乳糖酸含量的測定

檢測乳糖酸的方法如下:取發(fā)酵液離心，上清液滅酶經(jīng)微孔濾膜過濾(0.22μm)，濾液上HPLC分析。HPLC條件:Agilent1100色譜柱:Shodex SH1011 (8.0mm×300mm)，流動相為0.01mol/L H2SO4。檢測器:紫外檢測器，210nm，柱溫:50℃，流速:0.8mL/min，進樣量:10μL，乳糖酸標(biāo)樣濃度:1%(w/v)。

乳糖酸濃度的計算方法:峰面積/1938×1%，

乳糖轉(zhuǎn)化率的計算方法:C(LA)/C總(Lac) ×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對乳糖酸產(chǎn)量的影響

2.1.1 熒 光 假 單 胞 菌 Pseudomonasfluroscence SK17.001的生長曲線 由圖1可知，0～8h為菌體生長的延滯期，11～23h為菌體生長的指數(shù)期，23h后菌體生長進入穩(wěn)定期。

圖1 培養(yǎng)時間對菌體生長量的影響

2.1.2 發(fā)酵時間對熒光假單胞菌轉(zhuǎn)化乳糖酸的影響 由圖2可以看出，菌在對數(shù)生長期內(nèi)，乳糖的轉(zhuǎn)化率極低;進入穩(wěn)定期后，乳糖的轉(zhuǎn)化率增大，隨著時間的延長，轉(zhuǎn)化率增加的較少;40h乳糖的轉(zhuǎn)化率較高，55h乳糖的轉(zhuǎn)化率達到95%。

圖2 發(fā)酵時間對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.1.3 培養(yǎng)溫度對熒光假單胞菌轉(zhuǎn)化乳糖酸的影響

從圖3中可以看出，30℃時發(fā)酵液中乳糖酸的轉(zhuǎn)化率較高，說明30℃比較適合菌體生長和產(chǎn)酶，隨著溫度的升高，乳糖酸的轉(zhuǎn)化率急劇下降，在40～50℃時，乳糖酸轉(zhuǎn)化率極低。

圖3 溫度對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.1.4 pH變化對熒光假單胞菌轉(zhuǎn)化乳糖酸的影響

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.5時，發(fā)酵液中乳糖酸的轉(zhuǎn)化率較高，由此可以說明，發(fā)酵產(chǎn)乳糖酸的最適pH為6.5左右，而過酸和堿性條件均不適合產(chǎn)乳糖酸。

圖4 pH對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.1.5 搖瓶液體裝液量對乳糖轉(zhuǎn)化率的影響 固定發(fā)酵過程中搖床的轉(zhuǎn)速，通過改變搖瓶的裝載量，可以實現(xiàn)發(fā)酵過程中的不同通氣量，由此探討通氣量對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 裝液量對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

從圖5可以看出，裝液量越少，乳糖的轉(zhuǎn)化率越高，說明這種菌是一種需氧菌，在裝液量20～30mL之間，裝液量對底物轉(zhuǎn)化率的影響并不顯著。

2.1.6 接種量對乳糖轉(zhuǎn)化率的影響 接種量對發(fā)酵產(chǎn)乳糖酸的影響并不太明顯，在接種量為6%，即接種量為2mL左右時，乳糖的轉(zhuǎn)化率較高。

圖6 接種量對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 培養(yǎng)基成分對乳糖轉(zhuǎn)化率的影響

2.2.1 不同氮源對乳糖轉(zhuǎn)化率的影響 氮同碳一樣是構(gòu)成微生物細胞結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物中含氮物質(zhì)的重要營養(yǎng)物質(zhì)。在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，比較了幾種常見的無機氮和有機氮對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，有機氮源蛋白胨和酵母膏比無機氮源適合菌體生長和乳糖酸的轉(zhuǎn)化。蛋白胨和酵母膏的成分復(fù)雜，在發(fā)酵過程中，很有可能既作為碳源，又作為氮源被微生物利用。

在用蛋白胨和酵母膏作為有機氮源的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，乳糖的轉(zhuǎn)化率最高。

2.2.2 添加不同碳源對乳糖酸產(chǎn)量的影響 碳是構(gòu)成微生物細胞結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物中碳骨架來源的重要營養(yǎng)物質(zhì)。在轉(zhuǎn)化的基本培養(yǎng)基中，選取了幾種比較常見的單糖，考察其對乳糖轉(zhuǎn)化率的影響。

表1 不同氮源對乳糖轉(zhuǎn)化率的影響

在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，分別添加果糖和葡萄糖作為碳源，對乳糖的轉(zhuǎn)化率進行檢測，結(jié)果見表2。

表2 添加不同碳源對乳糖酸產(chǎn)量的影響

由表2可以看出，加入單糖后，乳糖的轉(zhuǎn)化率基本為零，說明單糖可作為優(yōu)勢碳源被菌體利用，對乳糖的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生阻遏。在培養(yǎng)基中加入葡萄糖或果糖后，菌體生長量增長很快，說明此菌也許不能利用乳糖作為碳源，而單糖是優(yōu)勢碳源。

3 結(jié)論

本實驗用的熒光假單胞菌 Pseudomonas fluroscence SK17.001在發(fā)酵培養(yǎng)基中氧化乳糖生成乳糖酸。菌種生長到平臺期時，開始大量生成乳糖酸，表明轉(zhuǎn)化生成乳糖酸的過程不是菌種生長所必需的，乳糖酸是一種次級代謝產(chǎn)物。

熒光假單胞菌是一種高度需氧的原核細菌，可利用葡萄糖，果糖等單糖作為碳源，進入機體進行代謝?？蓪⑷樘茄趸癁槿樘撬?，卻不被微生物體所利用。

熒光假單胞菌Pseudomonas fluroscence SK17.001產(chǎn)乳糖酸的最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度30℃，pH6.5，250mL搖瓶中液體培養(yǎng)基裝液量為30mL，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，最佳氮源為1%蛋白胨和1%酵母膏，乳糖濃度為3%時，培養(yǎng)時間55h，轉(zhuǎn)化率可達96%。

［1］Southard JH，Belzer FO.Organ preservation［J］.Annu Rev Med，1995，46:235.

［2］Shepherd RE，Issacson Y，Chensny L，et al.Lactobionic and Gluconic Acid Complexes of Fe II and Fe III;Control of Oxidation Pathways by an Organ Transplantation Preservant［J］.Inorg Biochem，1993，49:23－48.

［3］Isaacson Y，Salem O，Shepherd R E，et al.Lactobionic Acid as an Iron Chelator:A Rationale for its Effectiveness as an Organ Preserving［J］.Life Sciences，1989，45:2373.

［4］Hoffhine CE.Aqueous soluble salts o f erythromycin［P］.US Patent:2761859，1956.

［5］Sen Gupta ML，Bhattacharya N，Basu UP.Preparation of calcium lactobionate by electrolytic oxidation of lactose:Part I oxidation in electrolytic cell using stationary electrodes［J］.Indian Journal of Technology，1967，5:152－154.

［6］Gerling K G.Large－Scale Production of Lactobionic Acid－Use and New Applications［J］.International Dairy Federation，1998，9804:251－261.

［7］Hegenauer J，Saltman P，Ludwig D，et al.Iron－supplemented cow milk.Identification and spectral properties of iron bound to casein micelles［J］.J Agric Food Chem，1979，27(6):1294－1300.

［8］Toshiaki S，Shuichi Y，Seiichiro A，et al.Mineral absorption promoters containing lactobionic acid［P］.Japanese Patent: 07277991，1995a.

［9］Toshiaki S，Shuichi Y，Tomoko K，et al.Bifidus factors containing lactobionic acid ［P］ .Japanese Patent: 07277990，1995b.

［10］Gerling KG，Wilke D.Washing or detergent composition containing lactobionic acid or lactobionic acid salts［P］.US Patent:5069808，1991.

［11］Berardesca E，Distante F，Vignoli GP，et al.Alpha hydroxy acids modulate stratum corneum barrier function［J］.Brit J Dermatol，1997，137:934－8.

［11］Green JW.The halogen oxidation of simple carbohydrates. Advanced in Carbohydrate Chemistry［M］.New York:Acad Press，1948.

［12］Mikkel Nordkvist，Per Munk Nielsen，John Villadsen. Oxidation of Lactose to Lactobionic Acid by a Microdochium nivale Carbohydrate Oxidase:Kinetics and Operational Stability［J］.Biotechnology and Bioengineering，2007，97:694－707.

［13］Murakami H，Kawano J，Yoshizumi H，et al.Screening of lactobionic acid producing microorganisms［J］.J Appl Glycosci，2002，49:469－477.

［14］Hiromi Murakami，et al.Production of Calcium Lactobionate by a Lactose－oxidizing Enzyme from Paraconiothyrium sp.KD－3［J］.J Appl Glycosci，2008，55:127－132.

Study on the conditions of lactobionic acid production from Pseudomonas fluorescence SK17.001

BAI Hui－chai，ZHANG Yu，JIANG Bo*，MU Wan－meng，ZHANG Tao
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The strain of Pseudomonas fluorescence SK17.001 was used to convert lactose to lactobionic acid.The results were as follow:pH 6.5，30℃，with 30mL volume of liquid，1%peptone and 1%yeast extract，3%(w/v)lactose could be converted to lactobionic acid after 55h incubated，the ratio of conversion could reach to 96%.

lactobionic acid;Pseudomonas fluosecence;bioconversion

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0236－03

乳糖酸(lactobionic acid)是集抗老、保濕、抗氧化和促進機體更新等多種功效于一身的第三代果酸，本身存在于機體中，無刺激性問題。乳糖酸和金屬螯合能夠降低由于離子催化生產(chǎn)的氫氧基對組織的損傷［1］，因此可用在器官移植緩沖液中［2－3］，防止器官受到自由基的傷害;乳糖酸可促進大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的溶解性，如紅霉素的乳糖酸水溶液的溶解性比紅霉素高出50～100倍［4］;乳糖酸鈣的溶解性較高，可用來補充鈣的吸收，也可用來做葡萄糖酸鈣的過飽和溶液［5］。乳糖酸可以降低酸味，減少成熟時間［6］，促進礦物質(zhì)鹽的吸收，不增加氧化的風(fēng)味和氣味［7－9］。乳糖酸還可用來降解生物物質(zhì)，作為洗滌劑的成分［10］。乳糖酸具有最佳的保水性，可抗氧化，抗衰老，是化妝品中的主要組分。目前制備乳糖酸的方法有化學(xué)催化合成法［11］以及生物轉(zhuǎn)化法［12］。化學(xué)合成法會產(chǎn)生多種副產(chǎn)物和化學(xué)污染物，使得分離、純化步驟變得復(fù)雜。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)乳糖酸具有高效、低成本、轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)點［13－14］，因此近年來研究人員都在探索用生物轉(zhuǎn)化的方法來制備乳糖酸。本實驗采用的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluroscence SK17.001)是從土壤中篩選到的，保藏于典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2010216。以乳糖為轉(zhuǎn)化底物，添加碳源、氮源及無機鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基。本實驗對其轉(zhuǎn)化條件和培養(yǎng)基組分對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響進行了研究。

2010－10－21 *通訊聯(lián)系人

白會釵(1982－)，女，在讀博士，研究方向:食品生物技術(shù)。