鄧高燕，喻勇新，潘迎捷，劉 源，趙 勇

(上海海洋大學食品學院，上海201306)

電子鼻對兩種食源性致病菌在菌株水平上區(qū)分的研究

鄧高燕，喻勇新，潘迎捷，劉 源，趙 勇*

(上海海洋大學食品學院，上海201306)

利用基于金屬氧化物傳感器陣列的電子鼻技術(shù)對五株單增李斯特菌和五株副溶血性弧菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行研究，結(jié)合主成分分析(PCA)和聚類分析(CA)等化學計量學方法對電子鼻原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果顯示，電子鼻模式識別技術(shù)能夠很好地將五株單增李斯特菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物圖譜進行區(qū)分，而在同一技術(shù)條件下對五株副溶血性弧菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物圖譜只能進行部分區(qū)分，利用向這五株副溶血性弧菌的培養(yǎng)液中添加NaCl至飽和的方法，可以將五株菌完全區(qū)分開來，區(qū)分效果顯著增強。實驗表明利用電子鼻結(jié)合主成分分析和聚類分析技術(shù)對食源性致病菌在菌株水平上的區(qū)分和鑒定具有一定的可行性，有望將該技術(shù)開發(fā)成為一種快速、簡便、無損的食源性致病菌新型檢測分型方法。

電子鼻，副溶血性弧菌，單增李斯特菌，化學計量學方法，食品檢測

近年來，由沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌等食源性致病菌引起的食品安全問題報道不斷［1－4］。據(jù)WHO估計，全世界每年發(fā)生食源性疾病數(shù)達十億人次，每年約有二百萬兒童死于腹瀉，其中66%以上是由細菌性致病菌所致［1］。因此，開發(fā)快速的致病菌檢測技術(shù)成為保障食品安全的重要任務(wù)之一。目前常用于檢測和鑒定食源性致病菌的方法主要有分離培養(yǎng)鑒定法、生化鑒定法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等一些免疫學方法和基于DNA的一些分子生物學方法［2］。傳統(tǒng)的以分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)的檢測方法操作復雜，一般需要幾天或者多達一周的時間，且對致病菌的檢測特異性不高;免疫學方法特異性好、靈敏度高，但操作繁瑣，時間長，對實驗技能要求也很高［3］;分子生物學方法主要針對核酸進行檢測，但其所用的儀器都比較昂貴，而且需要對樣品進行細胞破壁提取核酸，過程復雜且會破壞樣品。因此，從食品安全的關(guān)鍵問題出發(fā)，研究快速、簡便、無損的食源性致病菌檢測方法已迫在眉睫。近年來，國內(nèi)外一些學者相繼利用電子鼻對微生物進行了一系列的檢測和區(qū)分研究。早在1997年，Gibson等［4］利用電子鼻技術(shù)在微生物屬水平上成功地區(qū)分了純培養(yǎng)條件下12種細菌和一種酵母菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。Pavlou等［5］率先利用含14根導電聚合物傳感器的電子鼻技術(shù)對體外培養(yǎng)的兩種細菌:梭狀芽孢桿菌和脆弱類桿菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行了研究，結(jié)果顯示能夠很好的在屬水平上區(qū)分這兩種細菌。Ritaban Dutta等［6］采用手持式的Cyranose 320電子鼻結(jié)合徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對常見的感染眼睛疾病的六種細菌進行了檢測和識別，在種水平上的準確區(qū)分率達到了98%。我們實驗室已經(jīng)利用電子鼻技術(shù)成功地檢測了蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、緩慢葡萄球菌三種不同屬的細菌在TSB培養(yǎng)液中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，能夠?qū)⒉煌瑢匍g細菌在TSB培養(yǎng)條件下所產(chǎn)生的氣味信息區(qū)分開來［7］，同時對單增李斯特菌不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行了檢測，通過電子鼻技術(shù)能夠很好的將不同培養(yǎng)時間的單增李斯特菌進行區(qū)分，并且發(fā)現(xiàn)該菌在生長8h后產(chǎn)生了特有的氣味物質(zhì)，為利用電子鼻等氣味指紋技術(shù)檢測微生物提供了有效的佐證［8］，之后檢測了一株分離自南美白對蝦的副溶血性弧菌經(jīng)純培養(yǎng)后產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌經(jīng)純培養(yǎng)后產(chǎn)生了明顯區(qū)別于空白純培養(yǎng)液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，表明電子鼻可以很好的應(yīng)用于純培養(yǎng)微生物的檢測［9］。但是，關(guān)于利用電子鼻對同屬同種不同株細菌間氣味信息區(qū)分的研究還比較少。2000年，McEntegart等［10］應(yīng)用電子鼻技術(shù)對兩株大腸桿菌的揮發(fā)性氣味進行了研究，但結(jié)果表明在該實驗方法下利用主成分分析不能將這兩株菌的氣味很好的區(qū)分開來。本研究是在本實驗室前人研究的基礎(chǔ)上，進一步利用電子鼻技術(shù)，對同屬同種不同株之間的單增李斯特菌以及副溶血性弧菌在TSB培養(yǎng)液中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行檢測，以探討應(yīng)用電子鼻結(jié)合化學計量學方法在菌株水平上對食源性致病菌區(qū)分的可行性，并向樣品中添加無機鹽［11－12］，利用鹽析作用來增加樣品中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的濃度，以增強電子鼻對菌株水平氣味信息的區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

培養(yǎng)基 胰酪胨大豆肉湯(TSB)，其成分包括胰蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.5g/L，購于上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司，培養(yǎng)基配制好后經(jīng)121℃高壓濕熱滅菌 20min;五株單增李斯特菌 Listeria monocytogenes ATCC7644、 Listeria monocytogenes ATCC13932、Listeria monocytogenes ATCC19112、Listeria monocytogene ATCC19117 與 Listeria monocytogenes ATCC19118，分別簡稱為:LM1、LM2、LM3、LM4與 LM5;五株副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus 1111、Vibrio parahaemolyticus 1112、 Vibrio parahaemolyticus 1113、Vibrio parahaemolyticus 1114與 Vibrio parahaemolytic us1115，分別簡稱為: VP1、VP2、VP3、VP4與VP5。

商品化的Fox－4000 Sensory Array Fingerprint(?？怂?000型氣味指紋分析儀，電子鼻)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液制備 從細菌菌種純培養(yǎng)的培養(yǎng)皿上挑取一環(huán)單菌落，接種于裝有100mL TSB培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，在37℃、180r/min搖床培養(yǎng)12h后作為種子液。再分別定量吸取種子液1mL接種到裝有100mL TSB培養(yǎng)液的 250mL三角瓶中，置于37℃、180r/min搖床上培養(yǎng)12～14h作為試樣樣品供E－nose檢測，經(jīng)分析細菌培養(yǎng)物的濃度在 108～109CFU/mL左右，最后將這些菌液作為實驗樣品供電子鼻檢測。定量吸取2mL培養(yǎng)好的菌液分裝到10mL的E－nose樣品瓶中，每個樣品做5個平行，每個實驗重復3次。

1.2.2 含飽和 NaCl的五株副溶血性弧菌菌液制備

由于五株副溶血性弧菌菌液的氣味可能不能被電子鼻很好的區(qū)分，因此向這五株菌菌液中添加固體NaCl至飽和，以增強其氣味信息，達到較好的區(qū)分效果。定量吸取2mL培養(yǎng)好的菌液分裝到10mL的E－nose樣品瓶中，然后在每個樣品中加固體NaCl至飽和，獲得含飽和濃度NaCl的五株副溶血性弧菌菌液，每個樣品做5個平行，每個實驗重復3次。

1.3 檢測方法

該電子鼻原始數(shù)據(jù)是以每根傳感器信號的最大響應(yīng)值為基礎(chǔ)建立的特征向量矩陣，然后采用化學計量學方法進行聚類和統(tǒng)計分析。傳感器所對應(yīng)的檢測方法及參數(shù)，詳見參考文獻［7］。本文采用主成分分析法(Principal Component Analysis，PCA)和聚類分析法(Cluster Analysis，CA)對樣品的原始數(shù)據(jù)進行分析。

主成分分析主要是將傳感器響應(yīng)的特征向量矩陣進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，并對降維后的特征向量進行線性分類，最后將分類結(jié)果以PCA散點圖的形式展現(xiàn)出來［13－14］。其基本思想是將原來眾多的變量重新組合成一組新的互相無關(guān)的幾個綜合變量，同時根據(jù)實際需要從中取出幾個較少的總和變量并盡可能多地反映原來變量的信息。聚類分析［15］是一類分類學與多元分析相結(jié)合的多元統(tǒng)計方法，它將電子鼻得到的特征向量矩陣置于一個多維空間中，按照空間關(guān)系的親疏程度進行分類，即根據(jù)變量彼此不同的屬性進行辨認，將具有相似屬性的變量聚為一類，按“物以類聚”的原則將特性相近的變量或觀察單位進行分類。本實驗利用樣品間歐氏距離的相似性對樣品空間進行分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 五株單增李斯特菌氣味的電子鼻分析

2.1.1 主成分分析(PCA) 圖1是對五株單增李斯特菌菌液樣品氣味進行電子鼻分析后獲得的PCA圖。傳感器陣列進行主成分分析得到前兩個主成分的貢獻率分別為90.859%和7.954%，表明PCA分析結(jié)果圖能夠很好反映樣品的整體信息。LM1～LM5分別為含LM1、LM2、LM3、LM4與LM5的氣味信息。從圖1可以看出每個樣品的5個重復點能夠很好的聚在一起形成一個個組群，表明實驗樣品的重復性很好;五株單增李斯特菌和空白TSB培養(yǎng)液的氣味指紋在PCA圖上能夠明顯的區(qū)分開來。

圖1 五株單增李斯特菌在TSB培養(yǎng)液上的氣味PCA分析

從生物分類學角度上比較，五株單增李斯特菌屬于同種同屬不同株的水平，它們的遺傳信息基本相同，僅存在一定的差異，而這種較小的差異可能使不同細菌對培養(yǎng)基分解能力出現(xiàn)差別，從而造成其代謝產(chǎn)物不同。結(jié)合圖1的分析結(jié)果也可以進一步表明，基于個體基因型的差別其產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物存在的個體差異還是能夠被電子鼻技術(shù)捕獲到并進行區(qū)分，因此基于微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的研究對單增李斯特菌在菌株水平上的區(qū)分是可行的也是有效的。

2.1.2 聚類分析(CA) 圖2為五株單增李斯特菌菌液氣味的聚類分析圖，B1～B5為空白TSB培養(yǎng)液樣品的五個平行，L11～L15、L21～L25、L31～L35、L41～L45與L51～L55分別為LM1、LM2、LM3、LM4與LM5五株菌菌液樣品的五個平行。從圖2中可以看出，30個樣品被準確的聚為六類，空白TSB培養(yǎng)液與五株單增李斯特菌菌液都各自聚為一類，與PCA結(jié)果一致。表明五株菌在TSB培養(yǎng)液中產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物存在的差異性，我們可以通過電子鼻技術(shù)在整體上展現(xiàn)出來。進一步表明電子鼻技術(shù)有足夠的靈敏度區(qū)分這五株細菌。

圖2 五株單增李斯特菌在TSB培養(yǎng)液上的氣味CA分析

2.2 五株副溶血性弧菌氣味的電子鼻分析

2.2.1 主成分分析(PCA) 圖3是對五株副溶血性弧菌菌液樣品氣味進行電子鼻分析后獲得的PCA圖。前兩個主成分的貢獻率分別為 90.859%和7.954%，樣品的整體信息被很好的反映了出來。

從圖3中我們可以看出，五株副溶血性弧菌菌液與空白TSB培養(yǎng)液的氣味指紋在PCA上不能夠被很好的區(qū)分開?？瞻譚SB樣品的5個平行能夠聚在一起，形成獨立的區(qū)域;而副溶血性弧菌VP1、VP2與VP5三株菌的菌液氣味信息有很多交叉的部分，表現(xiàn)在PCA上的氣味指紋有很多相似的地方，不能夠區(qū)分開來;同樣副溶血性弧菌VP3與VP4兩株菌的菌液氣味指紋信息也有部分交疊在一起，區(qū)分效果較差。該實驗結(jié)果表明，基于微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的研究對副溶血性弧菌在菌株水平上的區(qū)分有一定的限制，不能將實驗的五株副溶血性弧菌菌液的揮發(fā)代謝產(chǎn)物一一區(qū)分開來。

圖3 五株副溶血性弧菌在TSB培養(yǎng)液上的氣味PCA分析

2.2.2 聚類分析(CA) 圖4為五株副溶血性弧菌菌液氣味的聚類分析結(jié)果，圖中B1～B5為空白TSB培養(yǎng)液樣品的五個平行，V11～V15、V21～V25、V31～V35、V41～V45與 V51～V55分別為含 VP1、VP2、VP3、VP4與VP5五株菌菌液樣品的五個平行。從圖4中可以看出，30個樣品被聚為三類;空白TSB培養(yǎng)液、含VP1、VP2、VP5菌菌液樣品、含VP3、VP4菌菌液樣品。利用聚類分析同樣不能將實驗的五株副溶血性弧菌液的揮發(fā)代謝產(chǎn)物完全區(qū)分開來，該結(jié)果與PCA圖一致。表明五株副溶血性弧菌在TSB培養(yǎng)液中產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物存在的差異性較小，不能通過電子鼻技術(shù)區(qū)分開來。

圖4 五株副溶血性弧菌在TSB培養(yǎng)液上的氣味CA分析

針對本次分析結(jié)果，在接下來的實驗中，向這五株副溶血性弧菌的培養(yǎng)液中添加固體NaCl至飽和，因為無機鹽的加入可以增強樣品中離子強度，降低極性有機物在水中的溶解度即鹽析作用［16］，進一步探討電子鼻對這五株菌菌液氣味信息區(qū)分的能力。

2.3 添加NaCl至飽和的五株副溶血性弧菌培養(yǎng)液氣味的電子鼻分析

2.3.1 主成分分析(PCA) 圖5是五株副溶血性弧菌培養(yǎng)液加固體NaCl至飽和后氣味的電子鼻分析的PCA圖。傳感器陣列進行主成分分析得到前兩個主成分的貢獻率分別為97.205%和1.592%，同樣表明PCA分析結(jié)果圖能夠很好反映樣品的整體信息。從圖5中我們可以看出，加NaCl之后檢測的五株副溶血性弧菌菌液氣味與空白TSB培養(yǎng)液的氣味在PCA能夠被很好的區(qū)分開?？瞻譚SB樣品的5個平行能夠聚在一起，VP1、VP2、VP3、VP4與VP5五株菌的菌液各自的五個平行也能夠很好的聚在一起，完全地區(qū)分開。

圖5 添加NaCl至飽和的五株副溶血性弧菌在TSB培養(yǎng)液上的氣味PCA分析

為了更好地探討五株副溶血性弧菌的氣味信息在加NaCl至飽和與未加時的區(qū)別，實驗將電子鼻得出的兩組數(shù)據(jù)進行了整合，如圖6所示。其中，VP1、VP2、VP3、VP4、VP5與TSB是未加NaCl時的氣味信息，VP1(A)、VP2(A)、VP3(A)、VP4(A)、VP5(A)與TSB(A)是加NaCl之后的氣味信息。從圖6中，我們可以很好的看出，未加NaCl時，五株副溶血性弧菌菌液氣味與空白TSB培養(yǎng)液的氣味在PCA圖上不能夠被很好的區(qū)分開，其中VP1、VP2、VP3、VP4四株菌菌液的氣味信息有很多交疊在一起，只有VP5菌株的氣味信息區(qū)別于其他菌株;在加鹽之后，五株菌的氣味信息可以很好的區(qū)分開來。

本次實驗可以得出，基于電子鼻技術(shù)對副溶血性弧菌在菌株水平上的區(qū)分雖有一定的限制，不能將實驗的五株副溶血性弧菌菌液的揮發(fā)代謝產(chǎn)物一一區(qū)分開來，但可以通過添加無機鹽的方法，增加菌液揮發(fā)性物質(zhì)濃度，來達到完全區(qū)分的目的。

圖6 未加NaCl與添加至飽和時五株副溶血性弧菌在TSB培養(yǎng)液上的氣味PCA分析

2.3.2 聚類分析(CA) 圖7為添加固體NaCl至飽和的五株副溶血性弧菌菌液氣味與空白TSB培養(yǎng)液的氣味的聚類分析結(jié)果，圖中B1～B5為空白TSB培養(yǎng)液樣品的五個平行，V11～V15、V21～V25、V31～V35、V41～V45與 V51～V55分別為含 VP1、VP2、VP3、VP4與VP5五株菌樣品的五個平行。從圖7中可以看出，空白TSB培養(yǎng)液的五個平行可以聚在一起，VP1、VP2、VP4、VP3與VP5五株菌液樣品的各自五個平行也能夠很好的聚在一起。從該圖中信息我們可以得出，利用聚類分析可以將空白TSB、VP1、VP2、VP4、VP3與VP5五株菌液樣品的氣味信息很好的區(qū)分開來。該結(jié)果與不添加NaCl樣品的五株菌聚類分析結(jié)果相比，很大程度上增強了區(qū)分效果，同時也驗證了添加無機鹽引起的鹽析作用可以提高樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)的濃度，提高傳感器對樣品的區(qū)分度。

圖7 添加NaCl至飽和的五株副溶血性弧菌在TSB培養(yǎng)液上的氣味CA分析

3 結(jié)論與討論

基于不同微生物個體在生長的同時會根據(jù)各自的特異性產(chǎn)生一些揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(Microbial Volatile Organic Compounds，MVOCs)，人類可以利用此類物質(zhì)了解微生物生命活動本質(zhì)規(guī)律［17］。在生物學分類上，不同微生物個體的MVOCs往往不同，它們一般具有種屬特征，因此這些氣味物質(zhì)以及由它們組成的氣味指紋圖譜可以潛在的被用來作為微生物鑒定與檢測的依據(jù)［18－19］。近年來也有很多研究報道了基于氣味指紋技術(shù)在微生物檢測中的應(yīng)用，正如文章引言部分所述，電子鼻在細菌屬、種、株水平上都有一系列的研究。現(xiàn)有的結(jié)果顯示，電子鼻可以有效地區(qū)別屬、種水平上的細菌經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，但是在菌株水平上的研究還未有很好的研究結(jié)果，這可能是由于菌株水平上細菌在遺傳學上的親緣關(guān)系較近，難以將它們在生長過程中所產(chǎn)生的代謝物質(zhì)進行區(qū)分，也有可能是菌株水平上細菌產(chǎn)生特有的揮發(fā)性物質(zhì)較少，難以被儀器檢測出來。

在已報道的實驗中，由于被檢測樣品的濃度低，信號弱，有的研究者提出一些增大信號的方法，例如胥勛濤等人［20］研究出的一個結(jié)合氣體濃縮的電子鼻傷口病原菌檢測系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)對實驗室培養(yǎng)病原菌的稀釋頂空氣體進行測試，可以極大地提高電子鼻對傷口病原菌的區(qū)分能力。也有研究人員通過向樣品中添加無機鹽，利用鹽析作用來提高檢測率，F(xiàn)isher［21］在分析酒中污染物時，采用加入無機鹽的方法進行研究，分析結(jié)果高出了25%。本研究針對食源性致病菌，特別針對含鹽量高的腌制食品，含鹽量高，所以采用加鹽的方法來增強信號，結(jié)果表明，該方法的效果很好，可以達到完全區(qū)分的目的，有望應(yīng)用于實體樣品的檢測中。

本次實驗較之前的文獻所報道結(jié)果相比，對細菌在菌株水平上的區(qū)分有較大的突破性進展，在以后的實驗中還將會結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對不同菌株在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進行定性分析。綜上所述，電子鼻技術(shù)對食源性致病菌在菌株水平上的區(qū)分和鑒定具有一定的可行性，有望將該技術(shù)開發(fā)成為一種快速、簡便、無損的食源性致病菌新型檢測方法。

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Recognition of two food－borne pathogens at strain level by using electronic nose technology

DENG Gao－yan，YU Yong－xin，PAN Ying－jie，LIU Yuan，ZHAO Yong*
(College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

An electronic nose(E－nose)based on metal oxide sensor was used to detect the volatile metabolites from two pathogenic bacteria at the strain level.E－nose coupled with several chemometrics methods such as principal component analysis(PCA)and cluster analysis(CA)were used for statistical analysis.Qualitative discrimination results showed that the volatile metabolites of these five strains of Listeria monocytogenes(LM) could be distinguished by PCA pattern respectively，while the volatile metabolites of Vibrio parahaemolyticus(VP) under the same condition could only be partly distinguished.However，when adding NaCl to each five culture solution of VP until saturation，the volatile metabolites of these five strains VP could be distinguished obviously.The application of E－nose had a certain potential for distinguishing and identifying food－borne pathogens at the strain level，and this technology could be developed as a rapid and non－destructive method for detecting food－borne pathogens in the future.

electronic nose(E－nose);Listeria monocytogenes;Vibrio parahaemolyticus;chemometrics methods; food detection

TS207.4

A

1002－0306(2011)12－0142－05

2011－08－18 *通訊聯(lián)系人

鄧高燕(1986－)，女，在讀碩士研究生，從事食品微生物快速檢測方面的研究。

上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目(滬農(nóng)科攻字2005第4－2號，2006第10－5號，2009第6－1號);上海市教育委員會重點學科建設(shè)項目(J50704);上海海洋大學青年基金(A－2501－10－011506);國家自然基金項目(30901125)。