趙軍艷鄭艷敏 李 軒

(武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,天津 300162)

COX-2 和 P-STA T3、P-STA T5在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中的表達(dá)及意義

趙軍艷＊鄭艷敏 李 軒

(武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,天津 300162)

目的 觀察COX-2和P-STAT3、P-STAT5在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中的表達(dá)及其相互關(guān)系,探討環(huán)氧合酶2表達(dá)與JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系。方法 培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞,應(yīng)用免疫組化法檢測COX-2抑制劑塞來昔布處理人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721前后COX-2、P-STAT3、P-STAT5表達(dá)的變化。結(jié)果 COX-2、P-STAT3、P-STAT5在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721均呈高表達(dá),并且COX-2與P-STAT3、P-STAT5的表達(dá)呈顯著正相關(guān);應(yīng)用COX-2抑制劑塞來昔布后COX-2、P-STAT3、P-STAT5的表達(dá)均顯著降低,用藥前后相比差異有顯著性(P<0.01);但用藥后 COX-2與 PSTAT3、P-STAT5的表達(dá)無顯著相關(guān)性。結(jié)論 COX-2和JAK/STAT通路有密切聯(lián)系,抑制COX-2的過度表達(dá)可能影響JAK/STAT細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性。

環(huán)氧合酶-2; 塞來昔布; 肝細(xì)胞癌; P-STAT3; P-STAT5

COX-2與惡性腫瘤尤其是消化系統(tǒng)腫瘤關(guān)系密切,選擇性COX-2抑制劑塞來昔布已成為預(yù)防家族性腺瘤性息肉病的臨床藥物。COX-2與肝癌發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系,研究認(rèn)為[1]COX-2的過表達(dá)可能參與高分化肝細(xì)胞癌的致癌過程,在肝細(xì)胞癌發(fā)生的早期階段起重要作用。細(xì)胞信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,JA K/STA T通路與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切[2],在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,影響肝癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。目前關(guān)于COX-2與JA K/STAT通路之間的聯(lián)系尚無系統(tǒng)研究,本研究探討兩者在肝癌細(xì)胞的異常表達(dá)及其相互聯(lián)系,為尋求原發(fā)性肝癌新的治療思路提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1. 材料

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC-7721購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。環(huán)氧合酶-2抑制劑塞來昔布(Celecoxib)為美國輝瑞(pifzer)公司產(chǎn)品,用二甲基亞砜(DMSO)配成10-2mol/L的儲存液(DMSO終濃度控制在<1‰),避光、-20℃保存。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在含10%熱滅活小牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),細(xì)胞初始濃度為5×105/ml,指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

3.主要試劑

兔抗人 COX-2、P-STAT3、P-STAT5多克隆抗體,生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自北京中杉生物試劑公司,SP法免疫組化試劑盒,以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

4.方法及結(jié)果判斷

將SMMC-7721細(xì)胞以5×104/ml濃度接種于6孔板中滅菌蓋玻片(15mm×10mm)上,常規(guī)培養(yǎng)1d天后,用COX-2抑制劑刺激細(xì)胞,對照組不加刺激因素,培養(yǎng)24h后,取出蓋玻片,用新鮮配制的預(yù)冷固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)-20℃固定10 min。參照免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒說明,分別滴加50μl一抗(兔抗人 COX-2,P-STAT3,或 P-STA T5IgG,按 1∶100稀釋),4℃保濕過夜;滴加50μl二抗(生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,按1∶100稀釋)。中止反應(yīng)后蘇木素復(fù)染,1%鹽酸酒精分色,1%氨水反蘭,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。以一抗稀釋液代替一抗作陰性對照。用Motic Med 6.0醫(yī)學(xué)圖像彩色分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像半定量分析,每張圖片隨機(jī)選取陽性細(xì)胞密集的5個視野,測定肝癌細(xì)胞中COX-2、P-STAT3、P-STAT5的棕黃色陽性表達(dá)顆粒的平均光密度值。

5.統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)采用 SPSS12.5統(tǒng)計軟件分析處理,各項指標(biāo)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,同一指標(biāo)的兩組間比較采用t檢驗,檢驗水準(zhǔn)取α=0.05;各指標(biāo)間的關(guān)系計數(shù)資料采用列聯(lián)表相關(guān)性檢驗,計量資料采用直線相關(guān)分析。

結(jié) 果

1.COX-2、P-STAT3、P-STAT5在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中的表達(dá)

COX-2在SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)為細(xì)胞漿呈棕黃色或含棕黃色顆粒(見圖1,2);P-STAT3、PSTAT5在SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)為細(xì)胞漿或細(xì)胞核呈棕黃色或含棕黃色顆粒(見圖3-6);應(yīng)用COX-2抑制劑塞來昔布后 COX-2、P-STA T3、P-STA T5在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中的表達(dá)平均光密度值顯著低于用藥前(P<0.01)(見表1)。

2.COX-2與 P-STAT3、P-STAT5在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中表達(dá)的相關(guān)性

表1 應(yīng)用塞來昔布前后COX-2,P-STAT3和P-STAT5在人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721中的表達(dá)(±s)Table 1 Expression of COX-2,P-STAT3and P-STAT5in SMMC-7721 cells

表1 應(yīng)用塞來昔布前后COX-2,P-STAT3和P-STAT5在人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721中的表達(dá)(±s)Table 1 Expression of COX-2,P-STAT3and P-STAT5in SMMC-7721 cells

＊＊(vs control,P<0.01)

Control 100μmol/L Celecoxib COX-2 0.225 ±0.063 0.046 ±0.024＊＊P-STAT3 0.248 ±0.079 0.165 ±0.045＊＊P-STAT5 0.237 ±0.066 0.156 ±0.052＊＊

表2 應(yīng)用塞來昔布前人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中COX-2和 P-STA T3和 P-STA T5表達(dá)的相關(guān)性(r值)Table 2 The correlation of COX-2 and PSTAT3,P-STAT5 in SMMC-7721 cells(r value)

表3 應(yīng)用塞來昔布后COX-2和P-STAT3和P-STAT5表達(dá)的相關(guān)性(r值)Table 3 The correlation of COX-2 and PSTAT3,P-STAT5 treated with 100μmol/L Celecoxib(r value)

對COX-2與 P-STAT3、P-STAT5在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中表達(dá)各指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,用藥前 COX-2與 P-STAT3、PSTAT5在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中表達(dá)呈顯著正相關(guān) ,P-STA T3(r=0.635,P<0.01),P-STAT5(r=0.703,P<0.01);用藥后 P-STAT3與 PSTAT5表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.654,P<0.01),而COX-2與 P-STAT3、P-STAT5表達(dá)無顯著相關(guān)性(見表 2,3)。

討 論

COX是前列腺素(PG)合成過程中的重要限速酶,可將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N內(nèi)源性前列腺產(chǎn)物,維持機(jī)體各種生理病理過程。有兩種同工酶,即COX-1和 COX-2,COX-1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在大多數(shù)組織和細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),有多種生理功能。而COX-2定位于核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),一般只在受刺激時迅速合成,靜息時并不表達(dá)。細(xì)胞受各種刺激后經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)COX-2的轉(zhuǎn)錄,COX-2不僅是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶,而且與惡性腫瘤密切相關(guān)。

目前研究證實COX-2在多種腫瘤組織及細(xì)胞中過表達(dá),已成為腫瘤診斷及治療的一個新靶點[3]。細(xì)胞內(nèi)外許多因素通過不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響C0X-2表達(dá)[4]。COX-2與肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,其在肝硬化、肝癌患者肝組織中的表達(dá)均高于正常肝組織[5]。COX-2抑制劑(塞來昔布)可明顯抑制肝纖維化和癌前病變的發(fā)展[6,7],對肝癌細(xì)胞株有明顯的誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖的效應(yīng)[8]。目前,塞來昔布已應(yīng)用于臨床抗癌痛治療,且已被批準(zhǔn)用于家族性腺瘤息肉患者的治療,塞來昔布在臨床上預(yù)防結(jié)腸癌也取得一定成績。

隨著對COX-2基因在腫瘤發(fā)展中作用機(jī)制的不斷研究,目前認(rèn)為其作用機(jī)制可能為增加細(xì)胞增殖,抗凋亡[9];促進(jìn)腫瘤血管生成[10];調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附性,增加腫瘤細(xì)胞侵襲性[11];產(chǎn)生前列腺素 E2,破壞機(jī)體免疫監(jiān)視功能[12]等。COX-2抑制劑除了可以抑制COX-2以上作用外,還可產(chǎn)生一些不依賴于COX-2的作用[13,14]。大量研究證實COX-2抑制劑可抑制胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖,但其抗癌機(jī)制及療效尚缺乏更深入的研究。

JA Ks(Janus kinases)是一類重要的酪氨酸蛋白激酶,細(xì)胞因子與受體結(jié)合后激活JA K,進(jìn)而激活“信號轉(zhuǎn)錄子和轉(zhuǎn)錄激活子”(signal transducer and activator of transcription,STA T)。近年來發(fā)現(xiàn)JA K/STAT途徑的激活,影響細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)化,此通路與原發(fā)性肝癌關(guān)系密切。關(guān)于COX-2與JA K/STAT通路之間聯(lián)系目前鮮有報道,因此研究COX-2與 P-STAT3、P-STAT5在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中的表達(dá)關(guān)系及其應(yīng)用選擇性COX-2抑制劑后三者表達(dá)變化,有利于為原發(fā)性肝癌的臨床治療開拓新思路。

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明,COX-2與 P-STAT3、P-STAT5在肝癌細(xì)胞中均有強(qiáng)陽性表達(dá),COX-2多表達(dá)于細(xì)胞漿,P-STAT3、P-STAT5在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá),以細(xì)胞核表達(dá)為主。COX-2一般只在細(xì)胞受刺激時合成,定位于核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng);STAT3和STAT5屬于胞漿蛋白,其活化形式是磷酸化后形成同源或異源二聚體,轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核內(nèi)。STAT3和STAT5的過度活化與細(xì)胞異常增殖有密切聯(lián)系,是肝癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)重要途徑。本研究發(fā)現(xiàn)P-STAT3、P-STAT5在肝癌細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá),以細(xì)胞核表達(dá)為主。COX-2與 P-STAT3、P-STAT5在肝癌細(xì)胞中均有過表達(dá),且三者之間存在顯著相關(guān)性,表明COX-2和JA K/STAT通路異常激活可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)COX-2的過表達(dá)可能參與肝癌的致癌過程,COX-2可能在肝癌發(fā)生的早期階段起重要作用[1]。結(jié)合本研究結(jié)果,提示COX-2與JA K/STAT途徑相互聯(lián)系共同參與肝癌發(fā)生發(fā)展過程。

已有研究表明COX-2抑制劑能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[15],我們通過檢測 COX-2與JA K/STAT通路中重要信號分子P-STAT3、P-STA T5在肝癌細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中存在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)紊亂。COX-2過表達(dá)和JA K/STAT通路過度活化呈顯著正相關(guān)。應(yīng)用COX-2抑制劑后COX-2表達(dá)顯著下降,P-STAT3、P-STAT5表達(dá)也較前明顯減弱,說明COX-2抑制劑不僅通過直接抑制COX-2的過表達(dá)起到抑制肝癌細(xì)胞增殖、促凋亡作用,還通過不依賴COX-2途徑與肝癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是JA K/STAT通路之間相互作用,抑制此通路過度活化,從不同方面起到抑制細(xì)胞異常增殖及抗腫瘤作用。由此可見,進(jìn)一步深入研究COX-2抑制劑及其與JA K/STAT通路關(guān)系,有望在肝癌的靶向治療及化學(xué)預(yù)防方面開辟新途徑。

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圖 版 說 明

圖1 COX-2在肝癌7721細(xì)胞中的陽性表達(dá)。(×400)

圖2 應(yīng)用100μmol/L塞萊昔布24小時后COX-2在肝癌7721細(xì)胞中的陽性表達(dá)。(×400)

圖3 P-STAT3在肝癌7721細(xì)胞中的陽性表達(dá)。(×400)

圖4 應(yīng)用100μmol/L塞萊昔布24小時后P-STAT3在肝癌7721細(xì)胞中的陽性表達(dá)。(×400)

圖5 P-STAT5在肝癌7721細(xì)胞中的陽性表達(dá)。(×400)

圖6 應(yīng)用100μmol/L塞萊昔布24小時后P-STAT5在肝癌7721細(xì)胞中的陽性表達(dá)。(×400)

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of COX-2 in 7721 cells.(×400)

Fig.2 Expression of COX-2 in 7721 cells treated with 100μmol/L Celecoxib 24h.(×400)

Fig.3 Expression of P-STAT3in 7721 cells.(×400)

Fig.4 Expression of P-STAT3in 7721 cells treated with 100μmol/L Celecoxib 24h.(×400)

Fig.5 Expression of P-STAT5in 7721 cells.(×400)

Fig.6 Expression of P-STAT5in 7721 cells treated with 100μmol/L Celecoxib 24h.(×400)

The expression and significance of COX-2,P-STAT3and P-STAT5in hepatoma cells

Zhao Junyan＊,Zheng Yanmin,Li Xuan

(Department of Gastroenterology,A f f iliated Hospital of the Medical College of Chinese People’s A rmed Police Force,Tianjin300162,China)

Objective To study the expression and correlation of COX-2,P-STAT3and P-STAT5in hepatoma cells,and to observe the correlation between COX2 and JA K/STAT signaling pathway.Methods The changes of COX-2,P-STAT3and P-STAT5expressions were investigated with immunocytochemistry.Results The expressions of COX-2,P-STA T3,and P-STA T5in HCC were highly,and there were significantly positive correlations of COX2 with P-STA T3and P-STAT5.The expressions of COX2,PSTAT3and P-STAT5were significantly lower after treatment with COX2 inhibitor celecoxib(P<0.01),but there were no significant correalations between COX2 and P-STAT3or P-STA T5.Conclusion There is a significant relationship between COX2 and the JA K/STAT pathway,and the inhibition of the over-expression of COX-2 may have an effect on the activation of the JA K/STAT signaling transduction pathway in hepatoma cells.

COX-2; Celecoxib; Hepatoma cells; P-STAT3; P-STAT5

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.009

2010-06-10

2011-04-01

武警醫(yī)學(xué)院博士啟動金課題(WBS200814)

趙軍艷,女(1971年),漢族,主治醫(yī)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)