魏 全林敬陽左后娟費(fèi)宇杰彭 丹黃曉琳＊劉正湘＊

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院康復(fù)科,武漢 430030;2浙江省人民醫(yī)院心內(nèi)科,杭州 310014;3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430030)

質(zhì)粒pAAV-HRE-CD151的構(gòu)建和鑒定

魏 全1林敬陽2左后娟3費(fèi)宇杰3彭 丹3黃曉琳1＊劉正湘3＊

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院康復(fù)科,武漢 430030;2浙江省人民醫(yī)院心內(nèi)科,杭州 310014;3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430030)

目的 為了增加CD151基因轉(zhuǎn)染大鼠缺血心肌的效率和靶向特異性。方法 以質(zhì)粒pAAV-CD151為模板,采用克隆技術(shù),構(gòu)建一個含缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element,HRE)和CD151基因序列的腺相關(guān)病毒載體,通過 HRE促進(jìn)CD151在大鼠缺血心肌的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)過測序鑒定成功構(gòu)建了含缺氧反應(yīng)元件的質(zhì)粒pAAV-HRE-CD151。結(jié)論成功構(gòu)建了pAAV-HRE-CD151質(zhì)粒,為CD151治療缺血性心血管病的靶向研究奠定了基礎(chǔ)。

心肌缺血; CD151; HRE; 基因治療; pAAV-HRE-CD151

促血管生長因子的運(yùn)用為人類缺血性心血管疾病的治療研究開辟了一條新的途徑。研究顯示,CD151基因能促進(jìn)大鼠缺血后肢的新生血管形成以及能增加大鼠心肌缺血區(qū)域微血管數(shù)量[1,2]。進(jìn)一步的研究表明CD151基因能增加小型豬心肌梗死模型中的毛細(xì)血管和小動脈密度,從而改善心功能[3,4]。這些觀察都充分表明CD151基因能促進(jìn)缺血心臟的血管形成而用于心肌缺血的基因治療。

隨著基因治療研究的深入,人們越來越關(guān)注基因治療的安全性和導(dǎo)入方式的重要性。目前基因治療的導(dǎo)入方式主要包括病變部位直接注射、經(jīng)導(dǎo)管注射和靜脈注射,相對而言,靜脈注射是一種創(chuàng)傷性最小的、安全的基因?qū)敕绞?容易被臨床的病人所接受,但是它難以使外源基因在缺血區(qū)域高表達(dá)而促進(jìn)有效的血管形成,如果通過靜脈給予大劑量的外源基因,就可能會增加外源性基因?qū)ζ渌K器所產(chǎn)生的副作用,如血管瘤形成和視網(wǎng)膜病等[5,6]。雖然我們在以前的CD151動物實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到這些副作用,但在CD151將來的臨床應(yīng)用中,將這些可能的副作用限制到最小的程度是非常重要的。我們設(shè)想通過構(gòu)建一個含缺氧反應(yīng)元件和CD151基因序列的腺相關(guān)病毒載體靜脈導(dǎo)入CD151基因,利用缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element,HRE)來調(diào)節(jié)其在缺血區(qū)域的表達(dá)[7],以期增加CD151在缺血區(qū)域的表達(dá)而減少外源基因在非缺血部位或器官的表達(dá)。

材料和方法

1.材料

1.1 質(zhì)粒、菌株

含人類全長野生型CD151 DNA的質(zhì)粒pAAVCD151由本課題組前期構(gòu)建[8]。該質(zhì)粒的CD151基因后面帶有HA尾并且與 HA尾直接相連。大腸埃希菌 E.Col iDH5α購自美國Invitrogen公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Mlu I、Kpn I,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自 Fermentas公司;限制性內(nèi)切酶BamH I、DNA 連接酶、DNA Marker購自 Ta KaRa公司;引物及序列合成購自南京 Genescript公司。

2.方法

2.1 引物設(shè)計(jì)

按照引物設(shè)計(jì)原則,采用引物設(shè)計(jì)軟件(Primer Premier 5.0),根據(jù)已知的來源于人烯醇化酶(enolase,ENO)的 HRE序列和pAAV-CD151載體中CMV的序列設(shè)計(jì)2對引物,分別為 F1和 R1,F2和R2。其中 F1是 HRE的上游引物,引入Mlu I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),R1是 HRE的下游引物,含有BamH I酶切位點(diǎn);F2是CMV的上游引物,引入BamH I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),R2是CMV的下游引物,含有 Kpn I酶切位點(diǎn)。2對引物序列如下:F1:TCACGCGT AGGGCCGGACGT,R1:TA GGA TCC GGGGCTCCGT; F2 : CA GGATCCGGATCTAATAGTAATCAATTACGG,R2:GTGGTACCGTCGAGGCTAG。其中 F1下劃線處為Mlu I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),R1、F1下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn),R2下劃線處為 Kpn I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。引物由南京 Genescript公司合成,用去離子水配制成10 mmol/L。

2.2 質(zhì)粒pAAV-HRE-CD151的構(gòu)建

根據(jù)已知的來源于人烯醇化酶(enolase,ENO)的HRE序列用人工合成的方法加以合成,該序列為:AGGGCCGGACGTGGGGCCCCAGAGCGAC GCTGAGTGCGTGCGGGACTCGGA GTACGTGACGGAGCCCC,用引物 F1、R1對該序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)高保真聚合酶probest的使用說明配備。將引物 F1和 R1加入 PCR反應(yīng)體系中,PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min,95℃變性30s,59℃退火 30s,72℃延伸 1min,30個循環(huán),得到含Mlu I和BamH I酶切位點(diǎn)的 HRE序列。

用限制性內(nèi)切酶Mlu I和 Kpn I同時切質(zhì)粒pAAV-CD151得到含Mlu I頭和 Kpn I尾的CMV序列(918bp)和含Mlu I頭和 Kpn I尾及CD151基因序列的AAV載體(4029bp),瓊脂糖膠電泳分離兩片段,紫外燈下分別切下含兩序列的膠,用質(zhì)?；厥赵噭┖谢厥諆善巍?/p>

以酶切回收的 CMV系列為模板,利用引物F2、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)高保真聚合酶probest的使用說明配備。將引物F2和R2加入PCR反應(yīng)體系中獲得含BamH I頭和Kpn I尾的CMV序列,PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30s,59℃退火30s,72℃延伸1 min,30個循環(huán),瓊脂糖膠電泳,紫外燈下切下含該序列的膠,用質(zhì)?；厥赵噭┖谢厥赵撈?。

用限制性內(nèi)切酶BamH I對 PCR后回收的HRE片段和CMV片段分別進(jìn)行單酶切反應(yīng),瓊脂糖膠電泳,紫外燈下切下含各自序列的膠,質(zhì)?；厥赵噭┖蟹謩e回收兩片段。

將單酶切后回收的序列 HRE和CMV進(jìn)行連接反應(yīng)(16℃恒溫水箱過夜),然后以連接產(chǎn)物為模板,以F1:5’-TCACGCGTA GGGCCGGACGT-3’(Mlu I)為上游引物 ,以 R2:5’-GTGGTACC GTCGA GGCTAGC-3’(Kpn I)為下游引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng),紫外燈下觀察,可見750bp-1000bp之間明亮條帶,切下含該條帶的膠回收,得到含Mlu I頭和 Kpn I尾的序列HRE-CMV。

將回收的 HRE-CMV序列用限制性內(nèi)切酶Mlu I和 Kpn I進(jìn)行雙酶切,酶切后瓊脂糖膠電泳回收。后將酶切回收的 HRE-CMV序列(Mlu I頭和含 Kpn I)與酶切回收的含Mlu I頭和含 Kpn I尾及CD151基因序列的 AAV載體進(jìn)行連接反應(yīng)(16℃恒溫水箱過夜),得到連接產(chǎn)物pAAV-HRECD151(圖 1)。次日將其轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 E.ColiDH5α,在固體LB上培養(yǎng)過夜后挑取單克隆搖菌,提取質(zhì)粒,測序。

圖1 質(zhì)粒pAAV-HRE-CD15的構(gòu)建示意圖Fig.1 The sketch map of construction of plasmid pAAV-HRE-CD151.

結(jié) 果

1.載體的制備

用限制性內(nèi)切酶 Mlu I和 Kpn I切質(zhì)粒pAAV-CD151得到含Mlu I頭和 Kpn I尾的CMV序列(918bp)和含Mlu I頭和 Kpn I尾的CD151基因載體(3965bp),在紫外燈下能見到750 bp-1000 bp及3000 bp-5000 bp之間明亮條帶(圖2),說明酶切及載體制備結(jié)果正確。

圖2 質(zhì)粒pAAV-CD151的酶切結(jié)果。750 bp-1000 bp之間的條帶為CMV序列,3000bp-5000 bp之間的條帶為含CD151的載體序列Fig.2 The bands between 750 bp-1000 bp was CMV sequence,The bands between 3000bp-5000bp was contained vector sequence of CD151.

2.PCR定性分析

將序列 HRE和CMV進(jìn)行連接,以連接產(chǎn)物為模板,以 F1、R2為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,在紫外燈下觀察,可見750bp-1000bp之間后明亮條帶(連接產(chǎn)物為996bp)說明 HRE與CMV連接成功(圖3)

圖3 以 HRE和CMV連接產(chǎn)物為模板的PCR。750bp-1000bp之間條帶為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 The bands between 750bp-1000bp was PCR cloning products.

3.pAAV-HRE-CD151質(zhì)粒測序

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌 E.Col i DH5α感受態(tài)細(xì)菌,挑選陽性單克隆搖菌,提質(zhì)粒并測序,測序結(jié)果表明質(zhì)粒pAAV-HRE-CD151構(gòu)建正確(圖4)。

圖4 質(zhì)粒pAAV-HRE-CD15的測序結(jié)果。231～298之間的序列為 HRE的反向互補(bǔ)序列Fig.4 This sequence was sequence of plasmid pAAVHRE-CD151,The sequence between 231-298 was the sequence of reversed complementary of HRE.

討 論

冠心病依然是當(dāng)今世界人群中致病率和病死率的主要原因。目前治療方法主要包括藥物治療、冠狀動脈介入治療和搭橋術(shù),其治療目的是通過增加血供以及減少心肌的耗氧量。然而,對于一些彌漫性動脈粥樣硬化的病人,介入治療或搭橋術(shù)的機(jī)會非常有限。利用促血管生成因子進(jìn)行治療性血管生成逐漸成為一種改善心肌缺血的新的治療方法[9-11]。動物及臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明運(yùn)用促血管生成因子如CD151、成纖維細(xì)胞生長因子及血管內(nèi)皮生長因子等能誘導(dǎo)缺血心肌區(qū)域的血管形成而改善心肌缺血和心臟功能[1,9,11]。CD151,為 TM4SF最重要的成員之一,由4個疏水跨膜區(qū)、一大一小兩個胞外環(huán)和兩個短的胞內(nèi)末端組成[12,13]。其高表達(dá)于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨核細(xì)胞及一些未成熟造血細(xì)胞[14,15],在調(diào)節(jié)體外內(nèi)皮細(xì)胞移動性和血管形成方面扮演重要的角色[16,17]。最新研究表明,CD151基因敲除的大鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞血管形成方面的能力如遷移、擴(kuò)散、浸潤、管狀和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成以及新芽形成能力均明顯減弱[18]。而利用CD151基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能提高細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的增殖、遷移和毛細(xì)管形成能力[19]。我們以前的研究表明CD151基因?qū)肽茉黾哟笫笮募」Ｋ滥Ｐ秃痛笫蠛笾毖Ｐ椭腥毖獏^(qū)域的微血管數(shù)量[1,2]。進(jìn)一步的研究表明CD151基因?qū)肽艽龠M(jìn)小型豬心肌梗死模型的血管形成并通過13N-NH3PET成像和超聲心動圖證實(shí)了CD151誘導(dǎo)的新生血管形成能有效地增加心肌灌注以及顯著地改善局部心肌功能[3,4]。所有這些觀察都充分表明CD151基因可以用于心肌缺血的治療,促進(jìn)血管形成。

導(dǎo)入的外源基因進(jìn)入血循環(huán),是可能在非缺血區(qū)分布和表達(dá)的,并可能引起不需要的血管生成,沒有調(diào)控的外源基因表達(dá)可能引起腫瘤樣血管和血管瘤形成等副作用[5,20]。為了缺血心肌基因治療的安全性以及限制不受控制的外源基因的表達(dá),理想的調(diào)控應(yīng)該是讓CD151基因具有靶向性,即在心肌缺血區(qū)高表達(dá),而在非缺血區(qū)不表達(dá)或低表達(dá)。在缺氧條件下,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)產(chǎn)生或上調(diào),并通過與缺氧反應(yīng)元件 HRE的結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達(dá),因此 HIF-1α/HRE是一個理想的控制外源基因表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)。HRE存在于人烯醇化酶、紅細(xì)胞生成素等基因中,其核心序列是(A/G)CGT(G/C)C,HRE已被用于調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子等基因的表達(dá)。因此,我們選擇將 HRE構(gòu)建到pAAV-CD151載體中,以增加CD151在心肌缺血區(qū)的表達(dá),從而促進(jìn)新生血管形成,為CD151基因治療心肌缺血的靶向性研究和將來的臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

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Construction and Identification of the plasmid pAAV-HRE-CD151

Wei Quan1,Lin Jingyang2,Zuo Houjuan3,Fei Yujie3,Peng Dan3,Huang Xiaolin1,Liu Zhengxiang3＊

(1Department of Rehabilitation Medicine,Tong ji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030;2Department of Cardiology of Zhejiang Provincial People’s Hospital,Hangzhou310014;3Department of cardiology,Tongji Hospital,Tongji Medical college,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030,China)

Objective To improve the delivery efficacy and target specificity of the pro-angiogenic gene CD151 to the ischemic heart Methods Taking pAAV-CD151 plasmid as the template and using clone technology,an AAV construct which includes hypoxia response element(HRE)and CD151 gene was generated to improve CD151 gene expression in the rat ischemic myocardiumResults Plasmid pAAV-HRECD151 was successfully constructed ,and the result was confirmed by sequencingConclusion Plasmid pAAV-HRE-CD151 was successfully constructed,which laid the foundation for the target study of the CD151 gene on ischemic heart

Cardiac ischemia; CD151; HRE; Gene therapy; pAAV-HRE-CD151

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.002

2010-12-10

2011-04-01

國家自然科學(xué)基金資助(30670856,81000047)

魏全,男(1979年),漢族,博士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)