潘建超薛東升 劉紹勇

（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201401）

近紅外漫反射光譜法快速測(cè)定黃芩藥材中黃芩苷和漢黃芩苷含量

潘建超*薛東升 劉紹勇

（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201401）

目的針對(duì)中藥生產(chǎn)中藥材質(zhì)量控制的問(wèn)題，運(yùn)用近紅外漫反射光譜技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，提出一種快速測(cè)定黃芩藥材中黃芩苷和漢黃芩苷含量的方法。方法利用HPLC法測(cè)定黃芩藥材中黃芩苷和漢黃芩苷的含量作為對(duì)照值，運(yùn)用偏最小二乘回歸（PLS）建立黃芩藥材近紅外光譜與HPLC法含量測(cè)定值之間的多元校正模型，并對(duì)未知樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果黃芩苷和漢黃芩苷校正模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.995、0.969，交叉驗(yàn)證誤差均方根RMSECV分別為0.678、0.143，驗(yàn)證集預(yù)測(cè)誤差均方根RMSEP分別為0.602、0.221。結(jié)論該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)黃芩藥材的快速分析，預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可推廣用于其他中藥材的質(zhì)量控制。

近紅外漫反射光譜；黃芩；偏最小二乘；藥材質(zhì)量控制

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效，其化學(xué)成分主要為黃酮類(lèi)物質(zhì)，如黃芩苷、漢黃芩苷等[1]，是黃芩藥材質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。常用的黃芩藥材分析方法有高效液相色譜法、紫外分光光度法等[2,3]，但上述方法操作繁瑣，分析耗時(shí)長(zhǎng)，不適合用于中藥生產(chǎn)中大批量藥材的快速分析。近年來(lái)，近紅外光譜技術(shù)以其快速、穩(wěn)定和無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)在煙草、制藥、食品等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[4-6]，本研究采用近紅外漫反射光譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃芩藥材中黃芩苷和漢黃芩苷含量的快速分析，為黃芩藥材的質(zhì)量控制提供了新方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Antaris傅里葉變換NIR光譜儀（Thermo Nicolet Corporation，USA），儀器配有Result 3.0B光譜采集軟件；Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；MILLIPORE超純水器（美國(guó)Millipore公司）；METTLER AE240電子天平（梅特勒－托利多上海有限公司）；FL-027高速臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），數(shù)據(jù)處理采用TQ Analyst 8.0和Matlab數(shù)據(jù)處理軟件。

1.2 試劑及樣品

實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。黃芩苷（110715-200514）、漢黃芩苷（080612）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

實(shí)驗(yàn)所用的黃芩樣品中30批由上海凱寶藥業(yè)有限公司提供，5批購(gòu)于杭州市各大藥房。以上35批黃芩藥材由于產(chǎn)地不同，其成分含量不均勻，為使樣本中各成分含量分布范圍更加均勻，將35批黃芩藥材按照不同比例進(jìn)行混合，得到47批實(shí)驗(yàn)室自制黃芩藥材粉末，共82批黃芩粉末樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品預(yù)處理

將黃芩藥材粉碎，過(guò)60目篩，過(guò)篩后的粉末置于烘箱中，60℃下干燥10h，將干燥后的黃芩粉末密封保存于干燥器中。

2.2 HPLC分析

色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：A相：0.2%甲酸-水，B相：0.2%甲酸-乙腈，梯度洗脫程序?yàn)椋?～10min，A相85%～70%；10～18min，A相70%～65%；18～24min，A相65%～65%；24～30min，A相65%～40%；30～31min，A相40%～1%；31～36min，A相1%～1%；流速：1mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；進(jìn)樣量：5μL。

精密稱(chēng)取黃芩藥材粉末10mg于5mL量瓶中，加提取溶劑（甲醇∶水∶甲酸＝70∶29∶1）超聲提取45min后，定容至刻度，搖勻，12000r/min離心10min，取上清液作為供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析。

2.3 近紅外光譜掃描條件

光譜采集條件：采用積分球漫反射法采集黃芩藥材粉末的近紅外光譜圖。光譜采集波長(zhǎng)范圍：4000～10000cm-1，分辨率：4.0cm-1，增益：2x，衰減：Empty，掃描次數(shù)：64次。見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩藥材粉末的近紅外漫反射光譜圖

2.4 運(yùn)用PLS法建立多元校正模型

選擇合適的建模波段，并對(duì)光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，采用偏最小二乘回歸（PLS）建立黃芩藥材粉末近紅外光譜與黃芩苷、漢黃芩苷HPLC含量測(cè)定值之間的多元校正模型。以交叉驗(yàn)證誤差均方根（RMSECV）為指標(biāo)，采用留一法交叉驗(yàn)證確定建模最佳主成分?jǐn)?shù)。模型對(duì)校正集樣本和驗(yàn)證集樣本的預(yù)測(cè)誤差分別用校正集預(yù)測(cè)誤差均方根（RMSEC）和驗(yàn)證集預(yù)測(cè)誤差均方根（RMSEP）來(lái)考核。

3 討 論

3.1 樣本異常點(diǎn)的剔除及分類(lèi)

在近紅外光譜掃描過(guò)程中，由于光譜儀系統(tǒng)誤差、樣品性質(zhì)差異較大等因素，可能出現(xiàn)異常光譜，這些異常光譜加入模型會(huì)影響模型的預(yù)測(cè)精度。本研究通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品近紅外光譜與平均光譜的馬氏距離，經(jīng)過(guò)Chauvenet 檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)異常光譜，將這兩個(gè)樣品剔除，剩余的80份樣品用來(lái)建模。為了使校正集樣本更具有代表性，同時(shí)在一定程度上避免校正集樣本分布不均勻，本研究采用Kennard–Stone（KS）分類(lèi)法對(duì)樣本進(jìn)行分類(lèi)，將80份黃芩樣品分成2類(lèi)，校正集樣本60個(gè)，驗(yàn)證集樣本20個(gè)。

3.2 黃芩樣品含量測(cè)定結(jié)果（%）

將黃芩藥材粉末按照2.2項(xiàng)下樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理，并進(jìn)行HPLC分析，分別得到校正集和驗(yàn)證集樣品中黃芩苷和漢黃芩苷的含量分布范圍，見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷和漢黃芩苷的含量分布范圍（%）

3.3 不同的光譜采集方式對(duì)模型性能的影響

本研究比較了兩種不同的光譜采集方式對(duì)模型預(yù)測(cè)性能的影響。分別采用積分球漫反射法和光纖探針漫反射法采集全部黃芩樣品的近紅外光譜圖，運(yùn)用相同的建模波段和光譜預(yù)處理方法進(jìn)行建模，分別得到黃芩苷和漢黃芩苷含量測(cè)定的校正模型，并對(duì)驗(yàn)證集中20份樣品進(jìn)行含量預(yù)測(cè)，比較兩種不同的光譜采集方式所得模型的性能參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2，由結(jié)果可知，采用積分球漫反射法所得的模型性能參數(shù)均優(yōu)于光纖探針漫反射法，對(duì)驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率較高，這可能是由于采用積分球漫反射法采集光譜時(shí)，樣品填充的松緊程度比較均一，減小了粒徑不均對(duì)光程的影響，且采集過(guò)程中樣品杯的勻速轉(zhuǎn)動(dòng)可以采集到不同位置樣品的光譜信息，得到的光譜信息更加準(zhǔn)確可靠。

表2 不同光譜采集方式所得模型性能參數(shù)

表3 不同光譜預(yù)處理方法所得模型參數(shù)比較

3.4 建模波段的選擇

運(yùn)用PLS方法建模時(shí)，建模前對(duì)光譜波段進(jìn)行篩選，可以更好地提取光譜中的有效信息，改善模型性能，提高計(jì)算速度。本研究采用相關(guān)系數(shù)法和方差圖譜來(lái)篩選建模波段。相關(guān)系數(shù)法是將校正集光譜的每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的吸收值與濃度值進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算，得到波長(zhǎng)與相關(guān)系數(shù)之間的相關(guān)圖，相關(guān)系數(shù)越大的波段，包含的樣品信息越多。圖2顯示了每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的相關(guān)系數(shù)圖，可以看出在4000～6200cm-1范圍的相關(guān)系數(shù)值較大，基本在0.50以上。方差圖譜是指所有樣品在每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)吸收值的方差圖，它反映了樣品在每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)吸收值的變化情況，方差大的波長(zhǎng)點(diǎn)包含的信息較豐富，更能體現(xiàn)樣品之間的差別。圖3顯示的是所有樣品在每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的吸收方差值，可以看出在4500～5500cm-1、6900～7500cm-1波段的方差值較大。綜合以上分析，本研究選用4500～7500cm-1區(qū)間作為建模波段。

圖2 每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)吸收值與對(duì)照值相關(guān)系數(shù)圖

圖3 近紅外光譜方差圖譜

3.5 光譜預(yù)處理方法的選擇

在近紅外光譜掃描過(guò)程中，環(huán)境溫度、濕度的變化，填充不均勻等因素可能引起光譜基線的飄移、噪聲和光散射等干擾，對(duì)光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以減少干擾，充分提取光譜中的有效信息，提高校正模型的預(yù)測(cè)精度。本研究比較了各種光譜預(yù)處理方法對(duì)黃芩苷和漢黃芩苷校正模型的R（交叉驗(yàn)證）和RMSECV的影響，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，對(duì)于黃芩苷模型，采用SNV，一階導(dǎo)數(shù)，Savitzky-Golay卷積平滑法的建模效果較好，而對(duì)于漢黃芩苷，采用原始光譜的建模效果較好。

3.6 校正模型的建立及預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 HPLC測(cè)定值與NIR光譜預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖

選擇合適的建模波段，并對(duì)光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，采用留一法交叉驗(yàn)證確定建模最佳主成分?jǐn)?shù)，采用偏最小二乘回歸（PLS）建立黃芩藥材粉末近紅外光譜與黃芩苷、漢黃芩苷HPLC含量測(cè)定值之間的多元校正模型，見(jiàn)圖4。黃芩苷和漢黃芩苷校正模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.995、0.969，驗(yàn)證集預(yù)測(cè)誤差均方根RMSEP分別為0.602、0.221，驗(yàn)證集黃芩苷和漢黃芩苷的相對(duì)預(yù)測(cè)誤差分別為-1.45%和0.62%，結(jié)果準(zhǔn)確，模型的預(yù)測(cè)性能良好。可見(jiàn)，采用所建立的近紅外光譜校正模型可以快速準(zhǔn)確地對(duì)黃芩藥材進(jìn)行分析。

3.7 小結(jié)

本研究提出了一種應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)快速分析黃芩藥材的方法，在比較了不同的光譜采集方式，篩選合適的建模波段和適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理方式的基礎(chǔ)上，采用偏最小二乘回歸法建立了黃芩苷和漢黃芩苷的近紅外光譜定量校正模型，模型成功建立后，在短時(shí)間內(nèi)就可以完成光譜采集，并計(jì)算出比較準(zhǔn)確的含量，提供準(zhǔn)確可靠的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)，尤其適用于中藥生產(chǎn)中大批量藥材的快速分析。本法快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，可進(jìn)一步推廣用于其他中藥材的質(zhì)量控制。

[1]符洪,肖新月,張南平,等.藥用黃芩中主要化學(xué)成分分析[J].藥物分析雜志, 2003,23(1): 33-39.

[2]宋雙紅,王哲制,張媛,等.黃芩藥材HPLC指紋圖譜的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2006,6(41): 413-417.

[3]李云鵬,黃蕓,魏春娥,等.紫外分光光度法測(cè)定黃芩中總黃酮含量[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2007,22(11): 36-39.

[4]He Y,Li XL,Deng XF.Discrimination of varieties of tea using near infrared spectroscopy by principal component analysis and BP model[J].J Food Engineering,2007,79(4): 1238-1342.

[5]瞿海斌,李斌,劉雪松,等.紅參醇提取液濃縮過(guò)程近紅外光譜在線分析方法[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2005,24(40): 1897-1903.

[6]孫君明,韓粉霞,閏淑榮,等.傅里葉近紅外反射光譜法快速測(cè)定大豆脂肪酸含量[J].光譜學(xué)與光譜分析,2008,6(28): 1290-1295.

R282.710.5；R917

B

1671-8194（2011）34-0054-03

*通訊作者