李辛雷，李紀元，范正琪

(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400)

紅花檵木葉片花色素提取及其性質研究

李辛雷，李紀元，范正琪

(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400)

以紅花檵木葉片為材料，對其花色素的提取條件及理化性質進行研究。結果表明，紅花檵木葉片花色素提取的最佳條件為：99.5%的甲醇、料液比1:5(g/mL)、浸提溫度60℃、浸提時間2h。紅花檵木葉片花色素具光、熱不穩(wěn)定性；在強酸性時穩(wěn)定，微酸近中性時變色。色素抗氧化、還原能力差；對螯合劑、苯甲酸鈉敏感。葡萄糖、蔗糖對色素無明顯影響，食鹽、檸檬酸有增色作用，VC具減色作用。金屬離子A13+、Ca2+、Co2+等具增色作用，Cu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Sn2+等有減色作用，F(xiàn)e2+、Fe3+、Pb2+影響色素穩(wěn)定性。

紅花檵木；葉片；花色素；提取；性質

色澤是食品感官質量的重要指標之一，直接影響著消費者對食品的認可及對食品品質的評價，而色素是食品添加劑的一個重要組成部分[1]。人工合成色素具有色澤鮮艷、性質穩(wěn)定、成本低廉等特點，但多具有不同程度的毒性，有些甚至有致癌、致畸、致突變作用，越來越多的國家開始嚴格限制使用合成色素[2]。植物天然色素取材便利、安全性高、對人體毒害小甚至無毒害，很多天然色素含有人體必需的營養(yǎng)物質或者其本身就是維生素或具有維生素性質的物質；同時，部分天然色素具有藥理作用，對某些疾病具有防治作用，如黃酮類對心血管疾病具有防治作用；另外天然色素接近天然物質，滿足人們對環(huán)保、綠色的嚴格要求[3]?？梢灶A見天然色素將逐漸取代人工合成色素，成為色素開發(fā)的主流。

紅花檵木(Loropetalum chinensevar.rubrumYieh)為金縷梅科(Haamelidaceaem)檵木屬檵木(L. chinense)的變種，屬于常綠灌木或小喬木，是綠化美化的重要樹種，在我國廣泛應用[4]。紅花檵木資源豐富，其葉色暗紅，除含有葉綠素、類胡蘿卜素外，還含有豐富的花色素[5]，是開發(fā)天然色素的良好材料。目前，關于紅花檵木的研究主要集中于形態(tài)結構[6]、葉色變化的生理基礎[7]、品種登錄[8]、遺傳多樣性及親緣關系等方面[9-10]。在紅花檵木色素提取及性質研究方面，唐克華等[11]對紅花檵木花蕾中花色素進行了微波提取與特性分析，但目前關于紅花檵木葉片花色素開發(fā)利用的研究尚未見相關報道。因此，本實驗對紅花檵木葉片花色素的提取條件及其性質進行研究，以期為進一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花檵木無病蟲害的功能葉片，取自中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所苗圃，采樣時間為2010年8月，將葉片洗凈擦干后保存于－20℃冰箱中備用。

濃鹽酸、乙醇、甲醇、丙酮、甲酸乙酯、過氧化氫、亞硫酸鈉、E D T A、苯甲酸鈉、葡萄糖、蔗糖、食鹽、檸檬酸、V C等均為分析純。

1.2 儀器與設備

SP-755 PC型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；冰箱 青島海爾電冰箱股份有限公司；水浴鍋 北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅花檵木葉片花色素提取

取5份－20℃冰箱中保存的紅花檵木葉片，每份1.0g，直接研磨后按一定料液比(g/mL)加含體積分數(shù)1%濃鹽酸的提取劑，水浴鍋內浸提一定時間，冷卻后過濾，得紅色澄清透明液體。各浸提液分別用提取劑稀釋10倍，以相應提取劑作參比，用紫外-可見分光光度計在460～600nm波長范圍內掃描[12]，比較其最大吸收波長(λvismax)和最大吸收波長處的吸光度(Aλvismax)[13]。

1.3.2 紅花檵木葉片花色素性質

以含體積分數(shù)1%濃鹽酸的99.5%甲醇為提取劑，料液比1:5、60℃條件下浸提紅花檵木葉片花色素2h，過濾后于4℃、黑暗中冷藏備用。浸提液稀釋10倍后，在紫外-可見分光光度計460～600nm波長范圍內掃描，其吸收峰為530nm。檢測不同溫度、光照下530nm波長處的吸光度，觀察溶液顏色。

浸提液用純凈水稀釋10倍后加入具塞試管，調節(jié)pH0.0～9.0，黑暗中靜置2h，在460～600nm波長范圍內掃描，檢測最大吸收波長和最大吸收波長處的吸光度，觀察溶液顏色。

浸提液用純凈水稀釋10倍后，用紫外-可見分光光度計在460～600nm波長范圍內掃描，其吸收峰為510nm。取適量浸提液于具塞試管，分別加入不同濃度的金屬離子、氧化劑、還原劑、螯合劑和常用食品添加劑等溶液，混勻后在黑暗中反應2h，檢測510nm波長處的吸光度，觀察溶液顏色。各試驗處理均設3次重復。

2 結果與分析

2.1 紅花檵木葉片花色素的提取

2.1.1 提取溶劑對葉片花色素提取的影響

紅花檵木葉片研磨后以料液比1:20分別加入含體積分數(shù)1%濃鹽酸的純凈水、乙醇、甲醇、丙酮和甲酸乙酯等提取溶劑，50℃下浸提1h，浸提液過濾后適當稀釋，掃描結果見圖l。由圖1可知，各浸提液最大吸收波長分別為純凈水520nm、乙醇535nm、甲醇、丙酮和甲酸乙酯530nm。比較各浸提液的最大吸光度，甲醇的提取效果最好，浸提液為深紅色；其次為乙醇，浸提液為紅色；純凈水浸提液呈淺紅色；丙酮浸提液為橙黃色，甲酸乙酯浸提液呈墨綠色，兩者460～600nm波長范圍內呈現(xiàn)不規(guī)則曲線。因此，選擇甲醇作為浸提溶劑。

圖1 浸提溶劑對色素提取的影響Fig.1 Effect of solvents on pigment extraction

2.1.2 甲醇體積分數(shù)對葉片花色素提取的影響

紅花檵木葉片研磨后以料液比1:20分別加入含體積分數(shù)1%濃鹽酸的20%、40%、60%、80%和99.5%的甲醇，在50℃條件下浸提1h，浸提液過濾稀釋后掃描，不同體積分數(shù)的浸提液最大吸光度的波長均約為530nm，因此以530nm為檢測波長，比較不同體積分數(shù)浸提液的最大吸光度，結果見圖2。由圖2可知，99.5%甲醇的浸提液最大吸光度最高，浸提效果最好，其次分別為40%、20%和80%甲醇，60%甲醇的提取效果較差。

圖2 甲醇體積分數(shù)對色素提取的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on pigment extraction

2.1.3 時間對葉片花色素提取的影響

紅花檵木葉片研磨后以料液比1:20加入含體積分數(shù)1%濃鹽酸的99.5%甲醇，在50℃時分別浸提0.25、0.5、1、2、4h，浸提液過濾稀釋后，以530nm為檢測波長，比較各浸提液的最大吸光度，結果見圖3。由圖3可知，浸提效果2h＞1h＞4h＞0.5h＞0.25h。

圖3 浸提時間對色素提取的影響Fig.3 Effect of extraction time on pigment extraction

2.1.4 溫度對葉片花色素提取的影響

紅花檵木葉片研磨后以料液比1:20加入含體積分數(shù)1%濃鹽酸的99.5%甲醇，30、40、50、60、80℃時分別浸提2h，浸提液過濾稀釋后，以530nm為檢測波長，比較各浸提液的最大吸光度，結果見圖4。由圖4可知，浸提效果以60℃為宜。

圖4 溫度對色素提取的影響Fig.4 Effect of temperature on pigment extraction

2.1.5 料液比對葉片花色素提取的影響

紅花檵木葉片研磨后分別以料液比1:5、1:10、1:20、1:30、1:40(g/mL)加入含體積分數(shù)1%濃鹽酸的99.5%的甲醇，60℃時浸提2h，浸提液過濾稀釋后，以530nm為檢測波長，比較各浸提液的最大吸光度，結果見圖5。由圖5可知，隨料液比增大，各浸提液的最大吸光度逐漸降低，料液比1:5效果最好。

圖5 料液比對色素提取的影響Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on pigment extraction

2.1.6 pH值對葉片花色素提取的影響

紅花檵木葉片研磨后以1:5的料液比加入含體積分數(shù)1%濃鹽酸的99.5%甲醇，pH值分別調節(jié)為0.0、1.0、3.0、5.0、7.0，60℃浸提2h，浸提液過濾稀釋后掃描結果見圖6。由圖6可知，pH0.0、1.0、3.0時，浸提液最大吸光度的波長均為530nm；pH值為5.0和7.0時，浸提液吸光度隨波長增加而降低，吸收峰消失?？梢?，紅花檵木葉片色素在強酸性范圍內浸提效果較好，而堿性及弱酸性范圍內浸提效果較差。

圖6 pH值對色素提取的影響Fig.6 Effect of pH on pigment extraction.

2.1.7 紅花檵木葉片花色素提取條件的優(yōu)化

表1 紅花檵木葉片花色素提取條件優(yōu)化正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimization of pigment extraction

通過單因素試驗，初步確定了影響紅花檵木葉片色素提取的相關因素。為優(yōu)化提取條件，本實驗以甲醇為提取劑，用料液比(1:5、1:10、1:20、1:40)、甲醇體積分數(shù)(40%、60%、80%、99.5%)、浸提溫度(30、40、50、60℃)和浸提時間(0.5、1、2、4h)進行5因素(包括1個空白列)4水平正交試驗。正交設計試驗結果見表1，由極差(R)值可知，這4個因素的影響大小依次為：料液比＞甲醇體積分數(shù)＞溫度＞時間；最佳組合為正交設計中的第4個組合，即以99.5%的甲醇為提取溶劑，料液比1:5，60℃浸提2h的提取效果較好，正交設計與單因素試驗結果相符。

2.2 紅花檵木葉片花色素的性質

2.2.1 溫度對色素的影響

不同溫度下，隨時間延長葉片色素最大吸光度的變化見圖7。隨處理時間延長，A530nm持續(xù)降低，葉片色素紅色逐漸變淡，且溫度越高，作用越明顯。說明紅花檵木葉片色素耐熱性較差，高溫導致葉片色素部分降解。

圖7 溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on the stability of the pigments

2.2.2 光照對色素的影響

不同光照下葉片色素最大吸光度的變化見圖8，隨處理時間延長，日光、紫外光、日光燈光和室內自然光下葉片色素紅色變淡、A530nm持續(xù)降低。其中，日光的作用最強烈，表現(xiàn)較為明顯，其次分別為為紫外光、日光燈光、室內自然光。各種光下紅花檵木葉片色素均出現(xiàn)不同程度的降解，說明其具有光穩(wěn)定性差的特點。

圖8 光照對色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of light on the stability of the pigments

2.2.3 pH值對色素的影響

不同pH值對葉片色素最大吸光度及顏色的影響見表2，pH0.0～3.0時，最大吸收波長為510.0nm，隨pH值升高，A510nm逐漸降低；pH＞4.0時吸收峰消失。pH0.0～3.0時色素呈紅色，且隨pH值升高紅色變淡；pH4.0～6.0時，色素呈黃色且隨pH升高顏色加深；pH大于6.0時，色素逐漸顯黑色?？梢?，紅花檵木葉片色素在強酸性時較穩(wěn)定，微酸近中性時變色。

表2 pH值對色素穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of pH on the stability of the pigments

2.2.4 氧化劑、還原劑對色素的影響

圖9 H2O2 對色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of H2O2 on the stability of the pigments

圖10 還原劑、苯甲酸鈉、EDTA對色素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of Na2SO3, sodium beneoate and EDTA on the stability of the pigments

氧化劑過氧化氫對葉片色素最大吸光度的影響見圖9，隨過氧化氫體積分數(shù)增大，葉片色素紅色逐漸變淡，A510nm逐漸降低，體積分數(shù)大于0.5%時，A510nm逐漸升高，色素呈現(xiàn)橙黃色。還原劑亞硫酸鈉對葉片色素最大吸光度的影響見圖10，亞硫酸鈉質量濃度增大時，色素A510nm迅速降低，紅色逐漸變淡，質量濃度大于0.25%時，色素變?yōu)槌赛S色，A510nm逐漸升高。可見，紅花檵木葉片色素抗氧化、還原能力較差。

2.2.5 苯甲酸鈉、螯合劑對色素的影響

苯甲酸鈉、螯合劑EDTA對葉片色素最大吸光度的影響見圖10，苯甲酸鈉質量濃度增大時，A510nm逐漸降低，葉片色素紅色逐漸變淡，質量濃度為0.125g/100mL時，色素由淡紅色變?yōu)槌赛S色，大于0.25%，顏色無明顯變化，A510nm降低幅度變小。隨螯合劑EDTA質量濃度增大，A510nm逐漸降低，葉片色素紅色逐漸變淡?？梢姡t花檵木葉片色素對螯合劑、苯甲酸鈉敏感。

2.2.6 糖、食鹽對色素的影響

2.2.8 金屬離子對色素的影響

圖11 葡萄糖、蔗糖及食鹽對色素穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of glucose, sucrose and NaCl on the stability of the pigments

表3 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of metal ions on the stability of the pigments

葡萄糖、蔗糖及食鹽對紅花檵木葉片色素最大吸光度的影響見圖11，葡萄糖、蔗糖溶液中葉片色素均呈紅色，溶液質量濃度增大時，色素顏色無明顯變化，A510nm總體呈升高趨勢，但變化幅度不大。食鹽質量濃度升高導致葉片色素A510nm逐漸增大，紅色加深?？梢姡咸烟?、蔗糖對葉片色素影響不大，而食鹽引起其色澤加深。

2.2.7 檸檬酸、VC對色素影響

食品中常用添加物檸檬酸、VC對紅花檵木葉片色素最大吸光度的影響見圖12，隨檸檬酸質量濃度增大，色素紅色加深，A510nm逐漸增大。VC質量濃度增大時，葉片色素紅色逐漸變淡，A510nm逐漸降低。

從表3可知，A13+、Ca2+、Co2+等均可使紅花檵木葉片色素呈現(xiàn)紅色，且離子濃度越高，紅色越深，A510nm越大；Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Cu2+、Sn2+等亦均可使紅花檵木葉片色素呈現(xiàn)紅色，但離子濃度越高，紅色越淺，A510nm越??；低濃度Fe2+、Fe3+(3.125× 10-4mol/L)即使色素產(chǎn)生褐色沉淀；Pb2+在低濃度時色素呈紅色，濃度達3.125×10-4mol/L時色素呈褐色，6.250× 10-4mol/L時色素呈現(xiàn)暗綠色，并出現(xiàn)混濁。可見，紅花檵木葉片色素隨金屬離子及其濃度的不同而變化，F(xiàn)e2+、Fe3+、Pb2+影響紅花檵木葉片色素的穩(wěn)定性。

3 結 論

圖12 檸檬酸、VC對色素穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of citric acid and VC on the stability of the pigments

紅花檵木葉片色素呈現(xiàn)紅色，易溶于酸性醇溶液或酸性水溶液等極性溶劑中，酸性和近中性條件下的最大吸收波長介于510～540nm之間，屬于花色素特征峰變動范圍。紅花檵木葉片花色素提取的最佳條件為：99.5%的甲醇、料液比1:5(g/mL)、浸提溫度60℃、浸提時間2h。

4 討 論

本實驗中紅花檵木的葉片花色素易溶于水等極性較強物質，與唐克華等[14]對紅檵木花蕾花色素的研究一致。紅花檵木葉片花色素在不同提取劑中最大吸收波長不同，可能由于其吸收峰在不同的介質中發(fā)生位移，其偏移范圍與花色素的光譜特征相符[12]。浸提溫度、時間對紅花檵木葉片色素最大吸收波長無影響，但低溫或短時間時色素吸光度較小，可能由于色素浸提不完全；而高溫或長時間時，色素吸光度降低，可能主要在于高溫或長時間浸提使部分色素分解[15]。紅花檵木葉片花色素提取在低pH值時較穩(wěn)定，在pH值為微酸近中性時浸提液吸光度隨波長增加而降低，吸收峰消失，可能由于花色素及其苷結構被破壞[15]。本研究提取紅花檵木葉片花色素時，在已有單因素試驗的基礎上，進行正交設計試驗，正交設計試驗結果與單因素試驗相符，各因素間是否存在互作有待于進一步研究。

植物色素的性質受溫度、光照、氧化劑及還原劑等影響，本實驗中紅花檵木葉片花色素具光、熱不穩(wěn)定性及抗氧化能力差的特點，這與唐克華等[11]對紅花檵木花蕾花色素理化性質的研究不完全一致，可能主要由于植物中不同種類的花色素具有不同性質[16]，具體原因有待于進一步研究。紅花檵木葉片色素在強酸性時穩(wěn)定，微酸近中性時變色，表現(xiàn)出花色素顏色因pH值而變的最重要特征，說明其具pH值依賴性[15]。紅花檵木葉片花色素隨金屬離子及其濃度的不同而變化，金屬離子A13+、Ca2+、Co2+等具增色作用，Cu2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Sn2+等有減色作用，而Fe2+、Fe3+、Pb2+等引起色素變色且出現(xiàn)沉淀，主要由于Fe2+等離子與葉片色素形成金屬絡合物的原故[17]。

[1]夏湘, 趙良忠, 袁其麗, 等. 雪峰蜜橘果皮色素的穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學, 2008, 29(12): 102-106.

[2]MEKKAWY H A, ALI M O, EL-ZAAWAHRY A M. Toxiceffect of synthetic and natural food dyes on renal andhepatic functions in rats[J]. Toxicology Letters, 1998, 95(6): 55.

[3]喬華, 張生萬, 李美萍, 等. 天然色素穩(wěn)定性研究及其新的類型劃分[J]. 食品科學, 2006, 27(9): 69-73.

[4]李晨東, 唐前瑞, 陳德富, 等. 不同來源紅檵木材料的RAPD分析及分類學探討[J]. 園藝學報, 2002, 29(3): 358-362.

[5]唐前瑞, 周樸華. 紅檵木不同變異類型形態(tài)特征與色素含量的比較[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報, 2001, 27(5): 362-366.

[6]唐前瑞. 紅檵木與檵術葉綠體超微結構比較研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報, 2003, 29(1): 41-42.

[7]唐前瑞, 陳德富, 陳友云, 等. 紅檵木葉色變化的生理生化研究[J].林業(yè)科學, 2006, 42(2): 111-115.

[8]VRUGTMAN F. International registration of cultivar names for unassigned woody genera[J]. Hortscience, 1994, 29(9): 970-971.

[9]GAWEL N J, JOHNSON G R, SAUVE R. Identification of genetic diversity amongLoropetalum chinensevar.rubrumintroductions[J]. Journal of Environmental Horticulture, 1996, 14(1): 38-41.

[10]李晨東, 唐前瑞, 陳德富, 等. 紅檵木的3＇端延長隨機引物擴增DNA (3＇-ERPAD)標記[J]. 生物技術, 2002, 12(4): 3-5.

[11]唐克華, 于華忠, 龔劍, 等. 紅檵木花色素的微波提取與特性研究[J].西北植物學報, 2005, 25(3): 568-574.

[12]HOLTON T A, COMISH E C. Genetics and biochemistry of anthocyanins biosynthesis[J]. Plant Cell, 1995(7): 1071-,1,083.,,

[13]趙昶靈, 郭維明, 陳俊愉. 理化因子導致梅花 南京紅 花色色素的顏色變化[J]. 廣西植物, 2004, 24(5): 471-477.

[14]唐克華, 陳璇, 陳功錫. 紅檵木花色素TLC分離與定性研究[J]. 食品科學, 2005, 26(9): 52-57.

[15]WATERHOUSE A I. Wine phenolics[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2002, 957(4): 21-36.

[16]MAZZA G, BROUILLARD R. The mechanism of co-pigmentation of anthocyanins in equeous solutions[J]. Phutochem, 1990, 29(4): 1097-1102.

[17]KONDO T K, YOSHIDA A, NAKAGEWA T. Structural basis of bluecolor development in flower petals fromCommelina communis[J]. Nature, 1992, 358(6): 515-518.

Extraction and Characterization of Anthocyanidins fromLoropetalum chinensevar.rubrumYieh Leaves

LI Xin-lei，LI Ji-yuan，F(xiàn)AN Zheng-qi
(The Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, China)

The anthocyanidinsins inLoropetalum chinensevar.rubrumYieh leaves were extracted by solvent extraction method and analyzed for their physico-chemical properties. The best extraction conditions were found as follows: 99.5% methanol as extraction solvent at a solid-to-liquid ratio of 1:5 (g/mL) for 2 h extraction at 60 ℃. The pigments were unstable to light and heating but stable to strongly acidic environments and had a different color in slightly acidic and nearly neutral environments. Their tolerance to H2O2 and Na2SO3 was poor and their sensitivity to EDTA and sodium benzoate was high. Glucose and sucrose had little effect on the pigments. Salt, citric acid and some metal ions such as A13+, Ca2+and Co2+had hyperchromic effect on them and vitamin C and other metal ions such as Cu2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, K+and Sn2+had hypochromic effect. Moreover, Fe2+, Fe3+and Pb2+affected the stability of the pigments.

Loropetalum chinense；leaf；anthocyanidin；extraction；property

TS202.3

A

1002-6630(2011)20-0057-06

2010-12-16

浙江省科技計劃項目(2007C32035)

李辛雷(1978—)，男，助理研究員，碩士，研究方向為觀賞植物遺傳育種。E-mail：lixinlei2020@163.com