郭倩倩，陶 妍*，謝 晶

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

南美白對蝦中4種病原菌的多重PCR檢測

郭倩倩，陶 妍*，謝 晶

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

根據(jù)沙門氏菌的侵染上皮細(xì)胞表面蛋白基因(invA)、單增李斯特菌的侵入關(guān)聯(lián)蛋白基因(iap)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)和副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素基因(tdh)分別設(shè)計4對特異性引物，并以細(xì)菌16S rRNA基因的部分保守序列為內(nèi)標(biāo)，通過對退火溫度、引物濃度等反應(yīng)參數(shù)的調(diào)整和優(yōu)化，建立的多重PCR方法為10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、dNTP 200μmol/L、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶2.5U，引物濃度分別為16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L，加無菌水至總體積為20 μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min、94℃變性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反應(yīng)共進(jìn)行30個循環(huán)。為檢驗該方法的可行性，進(jìn)一步對人工接種上述4種病原菌的南美白對蝦進(jìn)行多重PCR檢測。結(jié)果表明：對污染樣品直接提取DNA和預(yù)增菌后提取DNA再進(jìn)行多重PCR檢測，均能有效擴(kuò)增出各個目的片段；但預(yù)增菌處理后可使檢測限明顯降低，進(jìn)而大大提高檢測的靈敏度。本多重PCR方法可作為食品包括水產(chǎn)品中病原微生物的快速、靈敏和高效的檢測方法。

多重PCR；沙門氏菌；單增李斯特菌；金黃色葡萄球菌；副溶血性弧菌

眾所周知，傳統(tǒng)的微生物鑒定方法需分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定等多個步驟，操作復(fù)雜、周期長，不利于病原菌的快速檢測。近十年來，生物技術(shù)的發(fā)展為建立新型、快速、靈敏的病原微生物檢測方法提供了可能。例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即P C R(polymerase chain reaction)技術(shù)，它是一種對特定DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的技術(shù)。自1988年Chamberlian等[1]首次提出這一概念以來，該技術(shù)已被逐步應(yīng)用于核酸診斷的多個領(lǐng)域，特別是病原微生物的檢測方面。國內(nèi)許一平等[2]報道了對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測方法，但未用于實際樣品的測定；曾海燕等[3]建立了三重PCR體系用于鑒別消毒奶及其加工環(huán)境中的李斯特菌屬的幾種菌；2009年，遇曉杰等[4]報道了對生畜禽肉中沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行多重PCR檢測的方法。國外Jofre等[5]報道了應(yīng)用多重PCR技術(shù)同時檢測火腿腸中的單增李斯特菌和沙門氏菌；Germini等[6]對雞蛋中的大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和單增李斯特菌進(jìn)行了多重PCR檢測。

水產(chǎn)品因其含水量高、營養(yǎng)成分豐富，易受多種微生物污染，致使其檢測背景復(fù)雜，故迄今為止，關(guān)于多重PCR技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品中病原微生物檢測的報道較少。近來，報道了對文蛤(Meretrix meretrix)中副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的三重PCR檢測方法[7]，但未考察樣品前處理方法對檢測結(jié)果的影響。本實驗在上述研究的基礎(chǔ)上，以沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌表達(dá)的特異性蛋白的編碼基因為基礎(chǔ)，設(shè)計4對特異性引物，以16S rRNA基因為內(nèi)標(biāo)，建立多重PCR的優(yōu)化方法；并以人工接種這些病原菌的南美白對蝦(Penaeus vannamei)為檢測對象，對其應(yīng)用效果進(jìn)行評價；另外，比較被檢樣品未增菌和預(yù)增菌處理后對檢測靈敏度的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

共6株實驗菌，其中金黃色葡萄球菌購自上海市工業(yè)微生物研究所；沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)為本實驗室保藏的菌種；前4種菌為試驗菌，后兩種菌在引物特異性考察時使用。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR試劑、DNA Marker、6×Loadding Buffer、瓊脂糖等由天根生化科技有限公司提供。

1.2 細(xì)菌總DNA提取和引物設(shè)計

將上述6個菌種分別接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃搖床培養(yǎng)過夜；離心收集菌體后，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒對各種菌的基因組DNA進(jìn)行提取。

分別根據(jù)沙門氏菌的侵染上皮細(xì)胞表面蛋白基因(invA)、單增李斯特菌的侵入關(guān)聯(lián)蛋白基因(iap)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素基因(tdh)設(shè)計4對特異性引物，以細(xì)菌16S rRNA基因的部分保守序列為內(nèi)標(biāo)(表1)。

1.3 引物特異性的考察

為考察所設(shè)計的引物是否準(zhǔn)確和具特異性，先分別以沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、DNA模板1μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL；Taq DNA聚合酶0.5μL，加無菌水至總體積20μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min、94℃變性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反應(yīng)共進(jìn)行30個循環(huán)。然后，以6種菌基因組DNA的混合物為模板，分別使用上述與每種試驗菌相關(guān)的一對引物進(jìn)行單重PCR，以期考察所設(shè)計引物的特異性。

1.4 多重PCR體系的優(yōu)化

將4種試驗菌的基因組DNA混合物作為模板，使用相應(yīng)的4對引物進(jìn)行多重PCR。先采用如下的PCR體系：10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、DNA模板1μL、10μmol/L的各種試驗菌上下游引物0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，加無菌水至總體積20μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min、94℃變性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反應(yīng)共進(jìn)行30個循環(huán)。在上述反應(yīng)體系和條件下，分別對退火溫度、引物濃度、DNA模板濃度等因素進(jìn)行優(yōu)化。

表1 引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of primers

1.5 人工污染樣品的制備及PCR檢測

市售新鮮的南美白對蝦在無菌條件下剝殼、均質(zhì)后，用作菌污染的對象。將沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌分別接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃搖床培養(yǎng)過夜；取1mL菌液與9mL的生理鹽水混勻，10倍倍比稀釋，進(jìn)行平板計數(shù)，按下列方法操作：

①每種試驗菌取108～103CFU/mL共6個濃度，每個濃度的菌液取1mL接種至含10g碎蝦肉的90mL生理鹽水或營養(yǎng)肉湯中，立即提取DNA或37℃搖床培養(yǎng)16h后提取DNA進(jìn)行PCR檢測。

②將4種試驗菌的濃度分別調(diào)至108CFU/mL，混合均勻后，按10倍倍比稀釋至108～103CFU/mL，每個濃度的混合菌液取1mL接種至含10g碎蝦肉的90mL生理鹽水或營養(yǎng)肉湯中，立即提取DNA或37℃搖床培養(yǎng)16h后提取DNA進(jìn)行PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性的考察

圖1 4種試驗菌的單重PCR結(jié)果Fig.1 Singleplex PCR detection results of 4 pathogens

如圖1所示，先分別以各個試驗菌的基因組DNA為模板，加入各自的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得來自沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的984、763、484bp和202bp的特異性譜帶，其分子大小均符合各個毒素蛋白編碼基因的預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果。

將4種試驗菌及大腸桿菌O157:H7和蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA等量混合后作為模板，分別加入來自沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的各對引物，進(jìn)行單重PCR，結(jié)果如圖2所示，各對引物只能擴(kuò)增出一個片段，證明所設(shè)計的引物具有很好的特異性。

圖2 引物特異性的考察結(jié)果Fig.2 Specificity of the primers designed

2.2 多重PCR體系的優(yōu)化

首先，以各個試驗菌的基因組DNA為模板，分別加入相同濃度的各對特異性引物和16S rRNA引物，進(jìn)行二重PCR，分別成功擴(kuò)增到預(yù)期分子大小的各個特異性片段和內(nèi)標(biāo)16S rRNA的95bp的片段(圖3，泳道2～5)；然后，以4種試驗菌的混合DNA為模板，對各對引物濃度進(jìn)行調(diào)整后，進(jìn)行多重PCR，結(jié)果顯示4種試驗菌及16S rRNA的目的片段均得到有效擴(kuò)增(圖3，泳道1)。

圖3 4種試驗菌的二重及多重PCR結(jié)果Fig.3 Detection of 4 pathogens by diplex and multiplex PCR

影響多重PCR的因素較多，且每個因素對PCR的影響程度不同，本實驗主要對退火溫度、引物濃度及其他因素諸如dNTP濃度、緩沖液用量、模板濃度和延伸時間等進(jìn)行篩選和優(yōu)化。由于退火溫度對PCR的影響最大，首先加入等量各對引物，在其他條件不變的情況下，分別采用55～59℃的退火溫度進(jìn)行多重PCR，結(jié)果如圖4所示。在退火溫度為56、57、58℃時，來自4個試驗菌和一個內(nèi)標(biāo)的共5個目的片段均得到有效的擴(kuò)增；因為在后續(xù)的實驗中發(fā)現(xiàn)，57℃的擴(kuò)增穩(wěn)定性要高于56℃和58℃，因此選擇57℃為最佳退火溫度。在57℃的退火溫度時，其他條件不變，根據(jù)譜帶的明暗程度，分別增加或者減小各對引物的濃度，使各個目的片段達(dá)到最佳的擴(kuò)增效果。由圖5A可見，泳道2和3的各個譜帶顯示了最佳的擴(kuò)增效果，最終確定各對引物的濃度分別為16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L。此外，在對其他因素的優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)dNTP濃度、模板濃度和延伸時間等對PCR結(jié)果均沒有明顯的影響，僅緩沖液用量顯示2.0μL較其他用量具有更好的擴(kuò)增效果(圖 5B)。

圖4 不同退火溫度條件下的多重PCR結(jié)果Fig.4 Multiplex PCR detection at different annealing temperatures

圖5 引物濃度(A)和緩沖液用量(B)的優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization of primer concentration (A) and buffer quantity (B)

2.3 對人工接種病原菌的南美白對蝦的檢測

2.3.1 單重PCR檢測

圖6 未經(jīng)預(yù)增菌條件下南美白對蝦中沙門氏菌(A)和副溶血性弧菌(B)的單重PCR檢測結(jié)果Fig.6 Singleplex PCR detection of non-enriched Penaeus vannamei sample inoculated with Salmonella (A) and V.parahaemolyticus (B)

圖7 預(yù)增菌條件下南美白對蝦中沙門氏菌(A)和副溶血性弧菌(B)的單重PCR檢測結(jié)果Fig.7 Singleplex PCR detection of enriched Penaeus vannamei sample inoculated with Salmonella (A) and V. parahaemolyticus (B)

首先，采用各個單一試驗菌接種10g碎蝦肉后，直接提取污染樣品的基因組DNA進(jìn)行單重PCR檢測，結(jié)果顯示，各個菌的最低檢測限分別為沙門氏菌102CFU/mL(圖6A)、副溶血性弧菌103CFU/mL(圖6B)；單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌均為103CFU/mL(結(jié)果未顯示)；另一方面，對人工接種病原菌的樣品，經(jīng)過16h預(yù)增菌后再提取基因組DNA進(jìn)行單重PCR檢測，結(jié)果顯示，沙門氏菌(圖7A)和副溶血性弧菌(圖7B)的最低檢測限均為101CFU/mL；單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌亦均為101CFU/mL(結(jié)果未顯示)，證明對被檢樣品進(jìn)行預(yù)增菌可明顯降低檢測限。

2.3.2 多重PCR檢測

首先，將同濃度的4種試驗菌混合均勻后，稀釋至各個濃度梯度，接種10g碎蝦肉后直接提取污染樣品的基因組DNA，采用上述優(yōu)化的方法進(jìn)行多重PCR檢測，檢測限為104CFU/mL(圖8A)；另一方面，對接種后的樣品經(jīng)過16h預(yù)增菌后再提取基因組DNA進(jìn)行多重PCR檢測，檢測限明顯下降至101CFU/mL(圖8B)。

圖8 未經(jīng)預(yù)增菌(A)和預(yù)增菌(B)條件下南美白對蝦中4種病原菌的多重PCR檢測結(jié)果Fig.8 Multiplex PCR detection of non-enriched (A) and enriched (B)Penaeus vannamei samples inoculated with four pathogens

3 結(jié) 論

本實驗以沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌各自特異表達(dá)的毒素蛋白的編碼基因為檢測目標(biāo)，設(shè)計和篩選了對應(yīng)于各個毒素蛋白的特異性引物，并確保了各對引物所擴(kuò)增的片段在分子大小之間的差異，以便于多重PCR檢測；另外，16S rRNA基因在本實驗中作為一個內(nèi)標(biāo)，對PCR系統(tǒng)和反應(yīng)條件的分析和判斷具有非常重要的作用，通過16S rRNA基因的擴(kuò)增結(jié)果，可以對本實驗設(shè)置的不同反應(yīng)條件下PCR結(jié)果之間的差異進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和判斷。根據(jù)文獻(xiàn)[8]報道，在多重PCR中一個片段的擴(kuò)增會對另一個片段的擴(kuò)增產(chǎn)生抑止作用，據(jù)此，通過調(diào)整各對引物之間的濃度差異，使多重PCR結(jié)果得到有效的改善。多重PCR中另一個難點是在同時使用多對引物時退火溫度之間的差異，本實驗在對設(shè)計的多對引物進(jìn)行反復(fù)篩選后，最后確定在57℃時，使用4對引物及內(nèi)標(biāo)引物均能有效地擴(kuò)增到各自的目的片段。本實驗中緩沖液用量對PCR結(jié)果也有一定的影響，而dNTP濃度和模板濃度等影響很小，這些結(jié)果與張學(xué)敏等[9]的報道是一致的。

在建立多重PCR優(yōu)化方法的基礎(chǔ)上，以人工接種病原菌的南美白對蝦為檢測對象，考察了直接檢測與預(yù)增菌后檢測的效果。為獲得明確和明顯的結(jié)果，采用了16h的預(yù)增菌處理時間。結(jié)果表明：16h預(yù)增菌后，能顯著降低多重PCR的檢測限，與Amagliani等[10]的研究結(jié)果一致；另一方面，無論在預(yù)增菌前接種的菌液濃度如何，在預(yù)增菌后，最終的檢測限均能達(dá)到101CFU/mL，證明食品中病原菌的生長與侵入菌的數(shù)量關(guān)系不大，而與生長的時間有密切的關(guān)系。此外，由于副溶血性弧菌的生長條件比較特殊，用普通肉湯培養(yǎng)基不能使其與其他3種菌同時富集生長，所以采用分別培養(yǎng)的方法可以達(dá)到較好的增菌效果。進(jìn)一步的研究工作將聚焦于熒光定量PCR技術(shù)用于水產(chǎn)品致病菌的檢測及不同預(yù)增菌處理時間對多重PCR檢測靈敏度的影響方面。

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Detection of Four Pathogens in Penaeus vannamei by Multiplex PCR

GUO Qian-qian，TAO Yan*，XIE Jing
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

A multiplex PCR method was presented to detect Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus from Penaeus vannamei, which are main food-borne pathogens. Specific primers were designed according to the invasion protein A gene (invA), invasion associated protein gene (iap), thermo-stable nuclease gene (nuc) and thermo-stable direct hemolysin gene (tdh) from Salmonella, L. monocytogenes, S. aureus and V. parahaemolyticus, respectively. A fragment of conserved sequence of 16S rRNA gene was used as the internal control of amplifiable bacterial DNA. The optimal PCR reaction system was identified as a 20-μL mixture composed of 10 × PCR buffer (+Mg2+) 2.0 μL, dNTP 200 μmol/L, DNA template 1 μ L and Taq DNA polymerase 2.5 U, with primer concentrations of 200 nmol/L for 16S rRNA, 250 nmol/L for tdh, 300 nmol/L for nuc, 350 nmol/L for iap and 250 nmol/L for invA, respectively. One reaction cycle consisted of denaturation at 94 ℃ for 30 s, annealing at 57 ℃for 40 s, and extension at 72 ℃ for 1 min followed by 10 min, and this cycle was repeated 30 times.The method was validated using Penaeus vannamei artificially inoculated with tested pathogens. The results showed that various target DNA fragments could be amplified by the multiplex PCR method in both non-enriched and pre-enriched samples. However, the detection sensitivity was significantly increased by enrichment at 37 ℃. Thus, the multiplex PCR method developed in this study offers an efficient and rapid way for highly sensitive detection of pathogens in aquatic food products.

multiplex PCR；Salmonella；Listeria monocytogenes；Staphylococcus aureus；Vibrio parahaemolyticus

TS201.6

A

1002-6630(2011)10-0148-05

2010-07-11

上海市科委2008年度重點科技項目(08391911500)；2009年上海市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人計劃項目(09XD1402000)；上海市教育委員會重點學(xué)科建設(shè)項目(J50704)

郭倩倩(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：guoqianguo@163.com

*通信作者：陶妍(1961—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：ytao@shou.edu.cn