張 鐘，唐緒明，張 玲

(廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東 茂名 525000)

荔枝肉水溶性多糖提取工藝優(yōu)化

張 鐘，唐緒明，張 玲

(廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東 茂名 525000)

目的：以荔枝肉為原料，采用水溶劑提取技術(shù)從荔枝肉中提取水溶性多糖。方法：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)分析方法優(yōu)化水溶劑提取荔枝肉水溶性多糖的最佳工藝參數(shù)，并對(duì)多糖含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：水溶劑提取的最佳工藝參數(shù)為荔枝肉與水的比例1:17(g/mL)、提取溫度90.5℃、提取時(shí)間4.0h。此時(shí)的響應(yīng)值即提取率達(dá)到10.06%。提取所得的粗多糖，用苯酚-硫酸法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果多糖平均含量為6.71%。結(jié)論：響應(yīng)面法優(yōu)化荔枝肉多糖提取工藝參數(shù)是可行的。

荔枝肉；水溶性多糖；提??；工藝參數(shù)優(yōu)化

多糖是20多個(gè)單糖的聚合體，包括植物多糖、動(dòng)物多糖和微生物多糖[1]，目前，已從天然物質(zhì)中分離出來(lái)300多種多糖。從19世紀(jì)60年代，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)了多糖的生理活性[2]，包括抗凝血[3-4]、抗感染[5]、抗腫瘤[6-7]。

關(guān)于荔枝多糖提取方法的報(bào)道較少，已報(bào)道的提取方法主要有傳統(tǒng)的熱水浸提法、微波提取以及超聲波提取[8-10]。多糖是極性大分子化合物，大多采用不同溫度的水，稀堿溶液提取。但是由于酸和堿易引起糖苷鍵的斷裂而造成多糖的得率降低。故本實(shí)驗(yàn)采用熱水浸提荔枝多糖，在浸提參數(shù)中溫度、固液比和時(shí)間均影響多糖的浸提率，要根據(jù)需要選擇最佳的工藝參數(shù)。同時(shí)對(duì)荔枝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是由Box等[11]于20世紀(jì)50年代提出的一套統(tǒng)計(jì)方法。響應(yīng)面分析法用于確定各因素及其交互作用在加工過(guò)程中對(duì)非獨(dú)立變量的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法[12-13]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、生物工程、食品工程等方面[14]。R S M中較有代表性的方法是響應(yīng)面回歸(response surface regression，RSR)優(yōu)化程序，RSR的原理是用一個(gè)多元回歸方程(回歸函數(shù))擬合多因子與試驗(yàn)結(jié)果(響應(yīng)值)之間的關(guān)系，各因子與響應(yīng)值之間的顯著程度用方差分析驗(yàn)證從而確定該分析結(jié)果的可信度[15]。RSM軟件結(jié)合Graph2等繪圖軟件還能夠給出參數(shù)與響應(yīng)值之間的平面圖和立體圖，直觀地提供局部參數(shù)值和整體響應(yīng)面值之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而獲得明確有用的結(jié)論[16]。

本實(shí)驗(yàn)選用熱水作提取溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面試驗(yàn)分析法對(duì)荔枝多糖的熱水浸提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以最大限度提高荔枝多糖提取率，以期為后續(xù)研究提供參考，為荔枝多糖的開(kāi)發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

荔枝干(黑葉) 自制。從茂名官渡市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)新鮮黑葉荔枝，去掉枝葉和病、爛、裂果，用100℃熱水燙30s，撈起瀝干水后置60℃恒溫干燥箱中干燥，貯存?zhèn)溆谩?/p>

葡萄糖、8 0%苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、9 5%乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚(以上試劑均為分析純)、活性炭、木瓜蛋白酶。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-D蘇泊爾攪拌機(jī) 浙江蘇泊爾炊具股份有限公司；78HW-1恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機(jī)廠(chǎng)；722型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠(chǎng)；FA1140電子天平 上海天平儀器廠(chǎng)；EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械；TDL-5離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 荔枝肉水溶性多糖的提取工藝流程

荔枝干→除去殼、核→60℃熱水浸泡20min→攪拌機(jī)打漿→在熱水浴中浸提→浸提液趁熱過(guò)濾→濾液冷卻→離心去渣(5000r/min，15min)→真空濃縮至原體積1/4→用無(wú)水乙醇調(diào)至溶液乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%→置冰箱12h→離心(5000r/min，10min)→沉淀依次用適量80%乙醇、95%乙醇洗滌兩遍→恒溫箱中干燥至質(zhì)量恒定→荔枝粗多糖

1.2.2 水溶劑提取的條件

1.2.2.1 多糖的提取率計(jì)算

1.2.2.2 水溶劑浸提料液比的選擇

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的荔枝干肉5.0g，稱(chēng)取5組，每組3份，打漿，在70℃條件下，分別以料液比1:5、1:8、1:11、1:14、1:17、1:20(g/mL)浸提 3h。根據(jù)多糖的提取率確定水溶劑浸提最佳料液比。

1.2.2.3 水溶劑浸提時(shí)間的選擇實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的荔枝干肉5.0g，稱(chēng)取5組，每組3份，打漿，加熱提取的料液比根據(jù)上一實(shí)驗(yàn)確定，分別浸提2、3、4、5、6 h，溫度是7 0℃。根據(jù)多糖的提取率確定水溶劑浸提最佳浸提時(shí)間。

1.2.2.4 水溶劑加熱浸提溫度的選擇實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的荔枝干肉5.0g，稱(chēng)取5組，每組3份，打漿，加熱提取的料液比和浸提時(shí)間根據(jù)上一實(shí)驗(yàn)確定，分別在溫度是60、70、80、90、100℃進(jìn)行浸提。根據(jù)多糖的提取率確定水溶劑浸提最佳溫度。

1.2.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)給出的信息，以提取溫度，時(shí)間，料液比作為試驗(yàn)因素，運(yùn)用SAS 6.1軟件程序根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法(簡(jiǎn)稱(chēng)RSM)，以荔枝粗多糖提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.3 多糖含量的測(cè)定方法

采用苯酚-硫酸法：苯酚-硫酸試劑可與游離的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起顯色反應(yīng)，己糖在波長(zhǎng)490nm處(戊糖及糖醛酸在波長(zhǎng)480nm)有最大吸收，吸收度與含量呈線(xiàn)性關(guān)系。

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20mg，置于500mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，配成0.04mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，置于具塞試管中，各以蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL，然后加入6%重蒸酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，靜止10min，搖勻，室溫放置20min后于波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度，以2.0mL水按同樣顯色操作作為空白，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再以吸光度(A)對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度(C)做回歸處理，得回歸方程：A=0.0632C＋0.008(r=0.9959)。

1.3.2 樣品中荔枝多糖的含量測(cè)定

1.3.2.1 樣品溶液的制備

將荔枝干肉剪碎，精密稱(chēng)取1.9986g，用體積分?jǐn)?shù)80%的酒精浸泡過(guò)夜，濾去廢酒精，然后于索氏提取器中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%新酒精回流4h，殘?jiān)鼡]去溶劑后，加17倍的蒸餾水，于98℃浸提3.5h，浸提液趁熱過(guò)濾，用蒸餾水反復(fù)洗濾渣至250mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻備用。

1.3.2.2 樣品中荔枝多糖含量的測(cè)定

精密吸取1.3.2.1節(jié)所得樣品溶液0.4mL于具塞試管中，按1.3.1節(jié)的方法測(cè)定吸光度(A)，由回歸方程計(jì)算供試液中葡萄糖濃度(C)，按下式計(jì)算樣品中荔枝多糖含量。

式中：C為供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度/(μg/mL)；D為多糖的稀釋因子；m為供試?yán)笾悠返馁|(zhì)量/μg；f為換算因子(經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定黑葉荔枝多糖f值為2.252[9])。

多糖的稀釋因子D的計(jì)算：荔枝干碎肉經(jīng)提取后，用蒸餾水反復(fù)洗濾渣至250mL容量瓶中定容，然后取出0.4mL，接著以蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL，然后加入6%重蒸酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，所以D為5000。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶劑提取條件的確定

2.1.1 水溶劑浸提料液比

圖1 料液比對(duì)粗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

由圖1可以看出，料液比小于1:17時(shí)，隨著料液的增大，荔枝肉粗多糖的提取率也隨著提高；但料液比超過(guò)1:17后，粗多糖提取率略有下降，可能是由于料液比增大，在減壓濃縮時(shí)多糖容易降解，導(dǎo)致最終算出的提取率下降。因此，料液比選1:17為佳。

2.1.2 水溶劑浸提時(shí)間

圖2 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of soaking time on extraction rate of polysaccharides

由圖2可以看出，浸提時(shí)間小于4h時(shí)，隨著浸提時(shí)間的增加，荔枝肉粗多糖的提取率也隨之提高，但當(dāng)浸提時(shí)間大于4h后，隨著浸提時(shí)間的增加，粗多糖的提取率反而緩慢下降。在4h后隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率總體呈下降趨勢(shì)，部分原因可能是由于浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，降低了某些反應(yīng)的活化能，使多糖分子之間、多糖分子與其他分子之間形成新的作用力，增加分子之間碰撞機(jī)會(huì)，阻止多糖分子溶出；也可能是由于蛋白變性沉淀后包裹在果肉顆粒表面，導(dǎo)致多糖浸出率下降。因此，浸提時(shí)間以4 h為佳。

2.1.3 水溶劑浸提溫度

圖3 不同浸提溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖3可以看出，浸提溫度小于90℃時(shí)，隨著浸提溫度的提高，荔枝肉粗多糖的提取率隨之提高；但當(dāng)浸提溫度大于90℃后，隨著浸提溫度的提高，粗多糖的提取率略有所下降，因此浸提溫度選90℃為宜。

2.2 水溶劑提取多糖響應(yīng)面試驗(yàn)

RSM試驗(yàn)采用二次旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)得到15個(gè)組合試驗(yàn)點(diǎn)，測(cè)定每次試驗(yàn)中的結(jié)果獲得相應(yīng)的響應(yīng)面值見(jiàn)表2。將表2響應(yīng)面值輸入計(jì)算機(jī)，經(jīng)RSM回歸擬合后，得到對(duì)X1、X2、X3的回歸方程：

表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

表4 回歸系數(shù)取值及分析結(jié)果Table 4 Regression coefficients and their significance in the fitted regression model

用SAS軟件對(duì)該多元回歸方程進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3、4。

從表3、4可看出，二次回歸模型的F值為6.690，P＜0.05，大于在0.05水平上的F值，而失擬項(xiàng)的F值為0.549，P＞0.05，小于0.05水平的F值，該模型的R2=0.9233，說(shuō)明該模型擬和結(jié)果好，自變量與響應(yīng)值之間線(xiàn)性關(guān)系顯著，可以用于該試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。X1和X12交互作用在0.01水平上對(duì)多糖提取有極顯著作用，X1和X12在0.05水平上對(duì)多糖提取率作用顯著。

為了觀察某兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)多糖提取率的影響，對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，觀察在其他因素條件固定不變的情況下，某兩因素對(duì)多糖提取率的影響，經(jīng)SAS分析，所得的響應(yīng)面及其等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖4。

響應(yīng)曲面圖是響應(yīng)值在各試驗(yàn)因子交互作用下得到的，構(gòu)成一個(gè)三維空間曲面。從圖4可以看出，3個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響情況，等高線(xiàn)圖越陡峭表示因素的效應(yīng)越大，能揭示出各因素對(duì)多糖提取率影響的顯著性。同時(shí)，可以看出各交互因素的最佳作用點(diǎn)基本都落在試驗(yàn)范圍之內(nèi)，經(jīng)SAS軟件優(yōu)化后的各因素最佳試驗(yàn)組合為浸提溫度90.5℃、浸提時(shí)間4.0h、料液比1:17。三因素的顯著程度為：提取溫度＞浸提時(shí)間＞料液比。此時(shí)的響應(yīng)值即提取率達(dá)到10.06%。

圖4 各兩因素交互作用對(duì)提取率的影響Fig.4 Response surface and contour of any two factors on extraction rate of polysaccharides

唐小俊等[8]用熱水提取荔枝多糖，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化出的提取時(shí)間是4h，浸提溫度是100℃，而本實(shí)驗(yàn)溶劑提取法中采用RSR試驗(yàn)優(yōu)化出的提取時(shí)間為4h，浸提溫度是90.5℃，比采用正交試驗(yàn)優(yōu)化出的浸提溫度也降低了。

2.3 荔枝多糖的計(jì)算

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得黑葉荔枝肉中平均多糖含量為6.71%，RSD為0.47%，說(shuō)明本測(cè)定誤差小(表5)。

表5 荔枝(黒葉)多糖含量的計(jì)算結(jié)果Table 5 The content of polysaccharide in litchi flesh

3 結(jié) 論

采用水溶劑提取技術(shù)從荔枝肉中提取水溶性多糖，在水溶劑提取荔枝肉水溶性多糖的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，再通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)分析方法優(yōu)化了水溶劑提取荔枝肉水溶性多糖的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明：水溶劑提取的最佳工藝參數(shù)為荔枝肉與水的比例1:17(g/mL)、提取溫度90.5℃、提取時(shí)間4.0h。三因素的顯著程度為提取溫度＞浸提時(shí)間＞料液比。本實(shí)驗(yàn)用苯酚-硫酸法測(cè)定荔枝多糖，測(cè)得黑葉荔枝肉中多糖含量為6.71%，RSD為0.47%，說(shuō)明本測(cè)定誤差小，測(cè)定結(jié)果精確。

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Process Optimization for Extraction of Water-soluble Polysaccharides from Litchi Flesh

ZHANG Zhong，TANG Xu-ming，ZHANG Ling
(College of Chemistry and Life Science, Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000, China)

Objective: To explore the optimal extraction parameters for water-soluble polysaccharides from litchi flesh. Methods:A series of single-factor investigations followed by response surface analysis were carried out to optimize conditions for the extraction of water-soluble polysaccharides from litchi fresh. Sulfuric acid-phenol method was used to quantify polysaccharides.Results: The optimal extraction parameters were litchi flesh-to-water ratio of 1:17 (g/mL), extraction temperature of 90.5 ℃, and extraction time of 4.0 h. Under these conditions, the extraction rate was up to 10.06%, and the crude extract obtained showed an average polysaccharide content of 6.71%. Conclusion: It is feasible to optimize extraction parameters of water-soluble polysaccharides from litchi flesh using response surface methodology.

litchi flesh；water-soluble polysaccharides；extraction；optimal parameters

TS255.36

A

1002-6630(2011)10-0070-05

2010-07-29

廣東省高等學(xué)校人才引進(jìn)項(xiàng)目(201192)；茂名學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(2010r2)

張鐘(1962—)，男，教授，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：47108887@qq.com