張庭廷，胡 威，汪好芬，冉穎霞，鄭春艷

(安徽師范大學生命科學學院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室，安徽 蕪湖 241000)

九華山黃精多糖的分離純化及化學表征

張庭廷，胡 威，汪好芬，冉穎霞，鄭春艷

(安徽師范大學生命科學學院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室，安徽 蕪湖 241000)

采用傳統方法、酶法、超聲波提取以及酶法輔助超聲等多種手段對九華山多花黃精多糖進行提取，并用DEAE-纖維素柱層析與交聯葡聚糖分子篩法等對多糖進行純化、分級以及相對分子質量測定，采用紅外光譜以及氣相色譜法等對多糖的構型和組成進行分析。結果表明：纖維素酶輔以超聲提取方法最佳，多糖得率最高；多糖為雜多糖，其相對分子質量為8912，其組成為果糖:葡萄糖=8.7:1。

黃精多糖；分離純化；化學表征

黃精(Rhizoma polygonati)是百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum Mill.)多年生草本植物，具有補中益氣、延年益壽之功效。安徽省九華山地區(qū)是黃精的主要分布地之一，其資源非常豐富。

多糖是所有生命有機體的重要組成部分。中藥多糖有很強的生物活性，具有免疫調節(jié)[1-2]、抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]、保護心肌以及降壓[7-8]等藥理作用，黃精中多糖含量豐富。目前關于黃精多糖的生物活性已有較深入的研究：黃精多糖可通過升高小鼠腦和性腺組織端粒酶活性而有獨特的抗衰老作用[9]、黃精多糖可降低高血脂模型小鼠的血脂、可增強小鼠免疫功能[10-11]、對H22實體瘤、S180腹水瘤具有一定的生長抑制作用等[12]。然而關于黃精中多糖的含量、種類、組成以及分子量等則因黃精的產地不同而有明顯差異。黃趙剛等[13]對不同產地黃精中多糖含量進行了比較，發(fā)現產地不同，其多糖的含量區(qū)別很大，安徽九華山黃精中多糖最高，甚至達到了河南濟源的4倍之多；吳群絨等[14]報道滇黃精多糖有3種，其中滇黃精多糖Ⅰ主要是由葡萄糖組成的相對分子質量為8100的中性雜多糖；張曉紅等[15]報道內蒙古野生黃精中的多糖是由單一果糖組成的相對分子質量為7073的同多糖。但到目前為止，關于九華山多花黃精中的多糖種類、組成和分子質量以及其分離提純方法等尚未見報道。因此本實驗對九華山黃精多糖的提取工藝及其理化參數進行較深入研究，一方面為黃精多糖的開發(fā)利用提供新的依據，同時為多糖等生物活性物質的分離純化及其表征提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精原材料于2008年8月采于安徽省九華山，經安徽師范大學生命科學學院周守標教授鑒定為多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua.)。經洗凈，50℃烘干粉碎，過篩(6 0目)，備用。

葡萄糖標準品 Sigma公司；DEAE-52干粉 英國Whatman公司；纖維素酶及果膠酶 上海韻涵生物科技有限公司；交聯葡聚糖Sephadex G-100、標準品葡聚糖T5、T-10、T-40、T-70 意大利 Pharmacia公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ2100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FTS-40傅里葉變換紅外光譜儀 美國伯樂公司；FD-1冷凍干燥機 北京博醫(yī)康公司；層析柱、HL-2恒流泵 上海精密科學儀器有限公司；BSZ-100自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖分離提取的工藝流程

黃精干粉→石油醚回流脫脂(80℃，2h)→揮干溶媒→80%乙醇浸提，脫寡糖等(1h)→揮干溶媒→提取多糖→過濾→藥渣再重復提取一次→過濾，合并濾液，減壓濃縮至一定體積→加入4倍量95%乙醇沉淀過夜→棄上清液，收集沉淀→依次用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗數次→真空干燥得多花黃精粗多糖(Polygonatum cyrtonema Hua. Polysaccharides，PCP1)

1.3.2 多糖提取

多糖提取的具體方法與條件見表1。

表1 不同方法提取黃精多糖的條件Table 1 Conditions for extracting polysaccharides from Polygonatum cyrtonema Hua by different extraction methods

1.3.3 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[16]，以標準葡萄糖溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，通過Excel作圖求得回歸方程，待測多糖含量可通過回歸方程求出。

1.3.4 多糖的純化及其化學表征

1.3.4.1 蛋白質和小分子雜質的去除

采用體積分數5%三氯乙酸和Sevag(氯仿與正丁醇體積比為4:1)相結合的方法脫蛋白，至多糖相與下層氯仿-正丁醇相中間無變性蛋白為止。將脫蛋白后的多糖裝入直徑22mm，截留相對分子質量為3500的透析袋中，以除去多糖溶液中的小分子物質，再經脫水干燥，得混合黃精純多糖PCP2。

取PCP2 5.0mg，溶解于5.0mL蒸餾水中，用紫外分光光度計在波長200～400nm范圍作連續(xù)掃描，看是否有特征吸收峰，檢查多糖的純度。

1.3.4.2 離子交換柱層析法對多糖進行分級與純化

DEAE-52干粉經常規(guī)處理后裝柱。層析柱的直徑和高度的比為1:20，上樣后，接上洗脫裝置，經0.5～2mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫。洗脫液每5.0mL收集1管，每5管用苯酚-硫酸法跟蹤檢測，依吸光度對洗脫液體積作圖，收集單一峰，經減壓濃縮、透析去鹽、冷凍干燥，得黃精純多糖PCP3[17]。

1.3.4.3 交聯葡聚糖對多糖進行純化與相對分子質量測定

Sephadex G-100干粉3.0g經常規(guī)處理后裝柱(層析柱直徑與柱高比為1:30)、去離子水平衡、1.0mg/mL細胞色素c溶液2.0mL過柱，觀察色帶下移情況以鑒定新裝柱的質量。依次將已知分子質量的標準葡聚糖T-5、T-10、T-40、T-70及待測的黃精多糖PCP3上柱，用去離子水洗脫，流速3.0mL/h，每管3.0mL分部收集。用硫酸-苯酚法跟蹤檢測，以標準葡聚糖分子質量的對數(lgMr)對洗脫體積(Ve)作圖，得直線回歸方程，待測黃精多糖可依其洗脫體積通過回歸方程求出其相對分子質量[18]。

1.3.4.4 多糖分子構型分析

多糖分子構型測定采用KBr壓片法，通過紅外光譜分析。取1.0mg黃精多糖PCP3樣品，加入150.0mg干燥的KBr粉末，在瑪瑙缽中研磨均勻，再經壓片機壓成薄片，隨即上機于4000～400cm-1進行紅外掃描。

1.3.4.5 多糖的單糖組成分析

按文獻[17]制備糖腈乙酰酯化樣品溶液，再進行糖腈乙酰酯化單糖對照品溶液的制備。取各單糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖)對照品溶液2μL注入氣相色譜儀，確定各單糖的保留時間。然后取樣品PCP3溶液2μL注入色譜儀，記錄色譜圖[17,19]。

2 結果與分析

2.1 各種提取方法對黃精粗多糖得率的影響

不同提取方法和提取條件對黃精粗多糖得率的影響，結果見表2。

由表2可知，固液比1:20明顯好于1:15，經配對t檢驗，P＜0.05，所以在本研究的各種方法中采取的固液比均為1:20；而超聲1h的多糖得率幾乎是0.5h的兩倍，提取時間不同，差異顯著，兩組同樣經配對t檢驗，P＜0.05，因此在有輔助超聲時采用的時間均為1h；而在所有提取方法中，以纖維素酶輔助超聲提取得率最高，為20.6%，與單純水提時固液比1:20組相比，具有顯著性差異，P＜0.05；果膠酶輔助超聲得率雖不及纖維素酶輔助超聲得率高，但僅次于后者，兩組相比，沒有顯著性差異。

表2 不同提取方法和提取條件對黃精粗多糖得率的影響Table 2 Effects of different extraction methods and conditions on extraction rate of polysaccharides

2.2 葡萄糖標準曲線回歸方程

不同質量濃度標準葡萄糖與吸光度的回歸方程為：y = 0.0082x－0.0256，R2= 0.9991，線性關系良好。

2.3 多糖純度測定結果

2.3.1 脫蛋白以及透析后的PCP2純度

脫蛋白以及透析后的PCP2經測定其純度達到91.8%，紫外分光光度計在波長200～400nm處作連續(xù)掃描，在260nm與280nm波長處未發(fā)現有明顯吸收峰，見圖1，說明多糖中已基本不含蛋白質、多肽與核酸。

圖1 粗多糖的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of polysaccharide extract from Polygonatum cyrtonema Hua

2.3.2 DEAE-52柱層析后多糖分級及純度

圖2 DEAE-52柱層析的洗脫曲線Fig.2 DEAE-cellulose column chromatographic elution profile of polysaccharide extract from Polygonatum cyrtonema Hua

多糖PCP2再經DEAE-52柱層析的結果表明，黃精多糖經不同濃度梯度NaCl洗脫，只得到一個很大的單一峰(圖2)，表明九華山多花黃精中的多糖僅為一種。

對層析以及透析后的多糖純度測定表明此時的黃精多糖純度已達到了94.7%。

2.4 多糖的相對分子質量及分子篩后多糖的純度

4種標準葡聚糖相對分子質量的對數(lgMr)對其洗脫體積Ve作線性回歸，得到回歸方程y=－0.0611x＋11.452，R2=0.9949。根據回歸方程及PCP的洗脫體積計算出PCP的相對分子質量為8912。

葡聚糖凝膠過濾法除可將不同分子大小的多糖分開，也是純化多糖的最好方法，經凝膠分子篩過濾的多糖經鑒定其純度高達96.8%，是目前文獻報道中純度較高的多糖。

2.5 黃精多糖的紅外光譜分析

圖3 黃精多糖的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of polysaccharide extract from Polygonatum cyrtonema Hua

圖3表明：在2925、1240cm-1處有兩組特征峰，它們分別代表了糖類C－H的伸縮振動與變角振動，因而明確了該物質是糖類化合物；在887cm-1處的吸收峰，代表了吡喃糖β-端基差向異構的C－H變角振動，在2930cm-1附近，中等強度的吸收峰，是由C－H鍵伸展振動引起，證明了PCP2有吡喃糖的β-糖苷鍵結構；875、815cm-1為果聚糖相關吸收峰，綜合紅外光譜特征吸收峰，可以認為黃精多糖可能為果糖和葡萄糖組成的雜多糖。

2.6 多糖的組成

由圖4可知，黃精多糖是由果糖和葡萄糖組成的雜多糖，該結果與紅外光譜圖分析結果一致，通過外標法測得組成單糖的物質量比為果糖:葡萄糖=8.7:1。

圖4 黃精多糖單糖組成的GC圖Fig.4 GC chromatographic separation of monosaccharides in polysaccharide extract from Polygonatum cyrtonema Hua

3 結 論

九華山黃精多糖提取的工藝以纖維素酶法輔助超聲最佳，該多糖為單一的雜多糖，相對分子質量為8912，其組成為果糖:葡萄糖=8.7:1，多糖經DEAE-52柱層析以及交聯葡聚糖的凝膠過濾，最終純度達到96.8%。

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Separation, Purification and Chemical Characterization of a Polysaccharide Fraction from Polygonatum cyrtonema Hua in Jiuhua Mountain

ZHANG Ting-ting，HU Wei，WANG Hao-fen，RAN Ying-xia，ZHENG Chun-yan
(Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, College of Life Sciences,Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

The conventional method, enzymolysis, ultrasonic extraction and ultrasonic-assisted enzymolysis were compared for their effectiveness in extracting polysaccharides from Polygonatum cyrtonema Hua in Jiuhua Mountain. Ultrasonic-assisted enzymolysis was evaluated as the best method due to the highest polysaccharide yield. The polysaccharide extract obtained by the selected method was a single polysaccharide component according to DEAE-cellulose column chromatographic analysis.Infrared spectral analysis revealed that the polysaccharide fraction was a hetero polysaccharide. Its relative molecular weight was determined by dextran gel filtration method to be 8912. Based on gas chromatographic analysis, its monosaccharide composition was composed of fructose and glucose at a ratio of 8.7:1.

polysaccharides from Polygonatum cyrtonema Hua；separation and purification；chemical characterization

Q539.1

A

1002-6630(2011)10-0048-04

2010-07-22

蕪湖市科技開發(fā)重點項目(200761)；安徽師范大學重點項目(200918)

張庭廷(1955—)，女，教授，博士，主要從事生物活性物質的開發(fā)應用研究。E-mail：cyhztt@mail.ahnu.edu.cn