李紀(jì)元，朱高浦，楊艷春，倪 穗,2，周 斌

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；

2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；3.浙江銀象生物工程有限公司，浙江 臺(tái)州 317200)

溶劑浸提秋橄欖果實(shí)中番茄紅素工藝優(yōu)化

李紀(jì)元1，朱高浦1，楊艷春1，倪 穗1,2，周 斌3

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；

2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；3.浙江銀象生物工程有限公司，浙江 臺(tái)州 317200)

分別采用乙酸甲酯、丙酮、石油醚、二氯甲烷4種浸提劑，設(shè)計(jì)3種提取方法對(duì)成熟秋橄欖漿果中番茄紅素的提取效果進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析，獲得優(yōu)化小試提取工藝參數(shù)：在避光環(huán)境下，乙酸甲酯為浸提劑，料液比1:40(g/mL)，邊研磨邊浸提，循環(huán)浸提4次，真空濃縮蒸干溫度為57.8℃，此法可從秋橄欖漿果中獲得番茄紅素34.81mg/100g，回收溶劑可重復(fù)利用，濃縮粗提物中番茄紅素質(zhì)量濃度達(dá)6.4～7.5mg/100mL。乙酸甲酯適合作為秋橄欖番茄紅素的提取溶劑。

秋橄欖；番茄紅素；溶劑浸提；工藝參數(shù)

植物黃金——番茄紅素對(duì)預(yù)防前列腺癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌等有顯著效果，還具有預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力、延緩衰老等功效，越來越引起人們的重視，被譽(yù)為“21世紀(jì)保健品的新寵”[1-3]。番茄紅素是一種極強(qiáng)的抗氧化劑，能強(qiáng)烈清除自由基，對(duì)體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)活性均有促進(jìn)作用[4]。此外，在體育運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域的應(yīng)用也有報(bào)道[5-6]。目前世界上番茄紅素的開發(fā)主要有番茄果實(shí)提取、化學(xué)合成等方法，但進(jìn)入商品化的是主要以番茄果實(shí)為材料的提取。從營(yíng)養(yǎng)數(shù)據(jù)庫獲知，新鮮西紅柿番茄紅素含量為3mg/100g、番茄醬為29mg/100g[7]。Ingrid等[8]研究表明，秋橄欖中番茄紅素含量高達(dá)15～54mg/100g，同時(shí)也富含大量的β-胡蘿卜素、葉黃素等有益成分。目前番茄紅素市場(chǎng)需求存在極大缺口，尋找更高含量的番茄紅素資源尤為迫切，而秋橄欖有可能成為替代西紅柿成為生產(chǎn)番茄紅素的新型植物資源[9]?，F(xiàn)有的溶劑法提取番茄紅素，所用溶劑多為毒性大，對(duì)人體有害的氯仿、丙酮、烷類等提取后殘留較多[10]。本研究從溶劑種類、料液比、提取方式等關(guān)鍵影響因子著手，探討秋橄欖成熟漿果番茄紅素的提取工藝，在最大提取量的前提下，優(yōu)化工藝流程，且浸提劑符合國(guó)家食品安全之要求，旨在為番茄紅素的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋橄欖果實(shí)采摘于河南洛陽市；番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司。乙酸甲酯、丙酮、石油醚、二氯甲烷、無水硫酸鈉(均為分析純) 浙江三鷹化學(xué)試劑公司。液相色譜流動(dòng)相由體積分?jǐn)?shù)為65%氰化甲烷、25%二氯甲烷、10%甲醇及1g/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和0.1mL/L 2-氮-二異丙基乙胺組成(除BHT為化學(xué)純外，其他試劑均為色譜純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-755PC分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；Senco R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHB-3型循環(huán)水真空泵 上海申生科技有限公司；液相色譜島津LC-20AT 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 最佳吸收波長(zhǎng)選擇

取0.4mL番茄紅素濃縮液于試管中，用氮?dú)飧稍?，先?.4mL流動(dòng)相溶解，從中取50μL稀釋樣品通過預(yù)柱(30mm×4.6mm，5μm)，然后進(jìn)入反相C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，樣品在30min內(nèi)，流速為0.8mL/min采用等度洗脫的方法洗脫。全波段掃描，確定最佳波長(zhǎng)。

1.3.2 分光光度法測(cè)定番茄紅素含量

參照國(guó)標(biāo)法[11]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算番茄紅素含量。

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的提取液質(zhì)量濃度/(μg/mL)；V為浸提劑體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 提取方法

方法一：秋橄欖鮮樣經(jīng)研磨機(jī)低溫粉碎，稱取5g，加入50mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%抗氧化劑(BHT)的乙酸甲酯浸提劑搖勻，常溫浸提10min，過濾上清液。濾渣按照相同方法連續(xù)提取至無色，共需9次，耗時(shí)1.5h，測(cè)定每次OD485值；收集9次濾液混合，測(cè)O D值。

方法二：與方法一不同之處在于，秋橄欖鮮樣采用冰浴研磨勻漿。提取6次，耗時(shí)1.5h，測(cè)定每次OD485值；收集6次濾液混合，測(cè)O D值。

方法三：與方法一不同之處在于，采用乙酸甲酯浸提劑與秋橄欖鮮樣共同冰浴研磨勻漿，提取6次，耗時(shí)1.5h，測(cè)定每次OD485值；收集6次濾液混合，測(cè)O D值。

為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，均在上述3種方式中設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)樣品設(shè)稀釋1、3倍和5倍共3個(gè)稀釋梯度測(cè)定OD值。

1.3.4 最佳料液比選擇方法

根據(jù)1.3.3節(jié)的結(jié)果確定提取方法，設(shè)1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)共6個(gè)料液比梯度以確定最佳料液比。

1.3.5 最佳提取劑的選擇方法

根據(jù)1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)結(jié)果確定的最佳提取方法和最佳料液比，選擇以石油醚、丙酮、二氯甲烷、乙酸甲酯為比較溶劑，以選擇最佳提取劑。將提取液用無水硫酸鈉濾除水分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，再將油樹脂用最佳提取劑洗脫定容至100mL，測(cè)定OD值。

1.3.6 溶劑回收率和提取效果

回收1.3.5節(jié)的溶劑，并計(jì)算回收率，再用回收溶劑作為提取劑來檢測(cè)回收溶劑的提取效果。

1.3.7 粗體物中番茄紅素質(zhì)量濃度測(cè)定

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑分離，待無溶劑冷凝后，即可獲得呈樹脂狀、濃稠、顏色鮮紅、富含番茄紅素的粗體物濃縮液，根據(jù)1.3.3、1.3.4和1.3.5節(jié)結(jié)果確定的最佳提取方式、最佳料液比、最佳提取劑和濃縮方法來完成整個(gè)提取過程得到番茄紅素粗提物，取1mL粗提物稀釋10、20、30倍，在485nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，重復(fù)3次，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算番茄紅素質(zhì)量濃度。

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的提取液質(zhì)量濃度/(μg/mL)；X為稀釋倍數(shù)；10-3將提取液質(zhì)量濃度μg/mL換算為標(biāo)準(zhǔn)mg/mL單位系數(shù)。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)錄入和制圖采用Excel 2003；方差分析采用DPS 7.05進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素最佳吸收波長(zhǎng)確定

圖1 秋橄欖中番茄紅素最佳吸收波長(zhǎng)液相色譜圖Fig.1 UV-vis scanning spectrum of lycopene extract from autumn olive berry

番茄紅素有多個(gè)吸收高峰，因此需要選擇一個(gè)最佳波長(zhǎng)，要求不但能很好測(cè)定番茄紅素含量，而且能夠準(zhǔn)確區(qū)分番茄紅素異構(gòu)體和胡蘿卜素等。參照Ingrid等[8]提供色譜條件，篩選出以乙酸甲酯為番茄紅素提取溶劑，在485nm波長(zhǎng)處有特異吸收高峰，選為最佳吸收波長(zhǎng)(圖 1)。

2.2 不同浸提劑提取番茄紅素的效果

圖2 不同提取劑濃縮前后番茄紅素含量變化Fig.2 Effect of four solvents on extraction rate of lycopene

由圖2可知，乙酸甲酯的提取效果最好，和其他3種提取劑相比差異達(dá)顯著以上，且濃縮前后的趨勢(shì)一致；觀察濾渣亦可見丙酮和乙酸甲酯提取的顏色最淺，提取能力最好；二氯甲烷在用濾紙過濾時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間放置，僅有少量液體濾出，這可能與二氯甲烷密度大有關(guān)(二氯甲烷1.33＞乙酸甲酯0.92＞丙酮0.8，相對(duì)水密度=1時(shí))。

2.3 3種不同浸提方式的提取效果比較

圖3 不同提取次數(shù)對(duì)番茄紅素殘留量的影響Fig.3 Effect of repeated extraction time on extraction rate of lycopene

由圖3可以看出，3種提取方式的番茄紅素含量，除方法一外均隨著提取次數(shù)的增加而呈逐漸下降趨勢(shì)，可見番茄紅素的殘量隨著提取次數(shù)的增加而減少，且提取至第5次時(shí)其含量已經(jīng)很低，第6次趨近于零。經(jīng)方式一處理需要9次才接近提取完全。因此，出于節(jié)約成本考慮，一般提取4次(每次50mL提取液)即可；同時(shí)可推算出5g鮮樣需要浸提液200mL左右即可將番茄紅素較完全提取出來；其中方法三處理后，在前3次提取過程中含量都最高，且在第5和第6次提取的含量最低，由此可以看出方法三能在最少提取次數(shù)條件下獲得最大番茄紅素得率。因?yàn)樵诮徇^程中，研磨物料促進(jìn)了物料細(xì)胞壁破裂，從而提高其提取效率。

圖4 3種提取方式對(duì)番茄紅素含量的影響Fig.4 Effect of extraction method on extraction rate of lycopene

由圖4可以看出，通過方法三可獲得番茄紅素的最大提取量34.81mg/100g，顯著高于方法一(31.08mg/100g)和方法二(23.15mg/100g)，其中方法三和方法一相差10mg/100g以上，這可能是由于方法一提取次數(shù)過多，時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致番茄紅素分解，且其沒有研磨未能使番茄紅素充分釋放出來的緣故。方法三和方法二比較相差3mg以上，可能是由于方法二所耗時(shí)間長(zhǎng)造成的番茄紅素分解所致。由此認(rèn)定：合適的提取次數(shù)，盡量縮短提取時(shí)間，采用研磨破壁等工藝均為改善秋橄欖槳果中番茄紅素提取效率的重要因素。

2.4 料液比對(duì)提取番茄紅素的影響

圖5 不同料液比時(shí)的提取效率比較Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction rate of lycopene

由圖5可以看出，1:40作為料液比可以得到番茄紅素的最大含量，且顯著高于其他料液比；1:30、1:50、1:60之間的差異不顯著，觀察提取后的濾渣除1:10、1:20顏色微紅之外，其他均呈白色，可見1:30～1:60的料液比可將漿果的色素完全提取出來。

2.5 回收溶劑的回收率和提取效果

按照優(yōu)化的條件，即采用充分研磨，1:40(g/mL)料液比，反復(fù)取4次后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮后量取回收的溶劑，得到整體平均回收率為(97.29±0.01)%，其中濃縮后溶劑二氯甲烷回收率最高，可達(dá)(98.93±0.47)%；而石油醚回收率最低，為(95.64±0.64)%(表1)。濃縮后新試劑和回收試劑所提取的番茄紅素含量都沒有顯著差異，因此浸提劑可回收反復(fù)利用，節(jié)約成本；在番茄紅素油樹脂濃縮過程中，其濃度溫度可達(dá)到乙酸甲酯的沸點(diǎn)溫度57.8℃，從表1可以看出，無論是哪一種浸提劑，回收率無較大差異，說明番茄紅素具有較高的熱穩(wěn)定性。

表1 濃縮前后不同提取劑的回收率Table 1 Recovery rates of different organic extraction solvents after condensation

2.6 濃縮蒸干的番茄紅素油樹脂的含量

按1.3.7節(jié)的方式測(cè)得番茄紅素濃縮液的質(zhì)量濃度為6.4～7.5mg/100mL。

3 討 論

對(duì)農(nóng)林資源進(jìn)行微粒超微化處理，可以使其比表面積成倍增長(zhǎng)[12]，通過對(duì)3種提取方式的提取效果比較發(fā)現(xiàn)，研磨是提高番茄紅素提取率的最有效方式之一。在浸提過程中，采用研磨處理能使秋橄欖果實(shí)含番茄紅素的細(xì)胞壁破裂，加快番茄紅素釋放，不僅縮短浸提處理時(shí)間，降低番茄紅素的自然降解，而且可顯著提高番茄紅素在有機(jī)溶劑中的溶出率。提取次數(shù)和總的浸提時(shí)間也會(huì)影響番茄紅素的得率，要盡量縮短提取時(shí)間，研磨充分后立即開始過濾，并且把提取次數(shù)控制在4次左右，這可能是由于天然番茄紅素對(duì)光較敏感，在光照條件下很不穩(wěn)定造成分解所致，因此提取番茄紅素時(shí)，應(yīng)避光操作。雖然番茄紅素對(duì)光極為敏感，但卻具有良好的熱穩(wěn)定性能[13-15]。57.8℃濃縮前后的番茄紅素得率變化趨勢(shì)基本一致，因此出于效率最大原則考慮，選擇浸提劑的沸點(diǎn)不應(yīng)超過57.8℃。

秋橄欖果實(shí)富含的天然色素不溶于水和酒精等，在選用浸提劑時(shí)，應(yīng)首先考慮選用親油性有機(jī)溶劑來提取番茄紅素。選用了目前較為通用的提取試劑——丙酮、石油醚、二氯甲烷等作為對(duì)照，最后確定了乙酸甲酯作為優(yōu)化的提取溶劑，它具有沸點(diǎn)較低(乙酸甲酯沸點(diǎn)57.8℃，乙酸乙酯為77.06℃)、經(jīng)濟(jì)、有香味等允許在食品中少量殘留的優(yōu)點(diǎn)，克服了丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑雖然提取效率高，但毒性大的缺點(diǎn)，適合作為秋橄欖番茄紅素的提取。

秋橄欖是一種極具開發(fā)潛力的天然抗氧化劑，在我國(guó)尚處于野生狀態(tài)[16]，因此加快秋橄欖野生資源的引種馴化與培育，將來有可能成為替代番茄作為獲取番茄紅素的新型植物原材料。

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Optimization of Solvent Extraction Process for Lycopene from Autumn Olive Berry

LI Ji-yuan1，ZHU Gao-pu1，YANG Yan-chun1，NI Sui1,2，ZHOU Bin3
(1. Subtropical Forestry Research Institute, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, China；
2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China；
3. Zhejiang Silver-elephant Bio-engineering Company, Taizhou 317200, China)

A comparative investigation was carried out to evaluate and analyze the effects of four solvents and three extraction methods on the extraction of lycopene from autumn olive berry. The optimal process for lab-scale extraction of lycopene from autumn olive berry was as follows: Autumn olive berry was extracted repeatedly 4 times using methyl acetate as extraction solvent at a material/liquid ratio of 1:40 with grinding under light-free conditions, and then the extract was vacuum concentrated at 57.8 ℃. The resulting yield of lycopene was 34.81 mg/100 g of fruit. Meanwhile, the extraction solvent could be recycled. The content of lycopene in the concentrated extract ranged from 6.4 mg/100mL to 7.5 mg/100 mL. This study can offer an experimental reference for future industrial production.

autumn olive；lycopene；solvent extraction；process parameters

TS201.1

A

1002-6630(2011)10-0044-04

2010-07-04

浙江省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(2007C12117)；寧波市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2008C10029)

李紀(jì)元(1964—)，男，研究員，研究方向?yàn)橛^賞植物與花卉分子育種。E-mail：jiyuan_li@126.com