張會軍，張敬軒，李 揮*，張 巖

(河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050051)

凝膠滲透色譜-高效液相色譜法對辣椒醬中14種鄰苯二甲酸酯的同時檢測

張會軍，張敬軒，李 揮*，張 巖

(河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050051)

建立辣椒醬中14種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)檢測方法。樣品通過石油醚超聲提取，GPC凈化，氮吹濃縮后，以乙腈-水為流動相，經(jīng)Warters-C18(250mm×4.6mm，5μm)液相色譜柱分離，進行HPLC-DAD分析。方法線性相關(guān)系數(shù)r＞0.998，檢出限為0.25～2.0mg/kg，在10mg/kg添加水平時樣品加標回收率為85.7%～100.8%，RSD為0.37%～4.57%。該方法靈敏、快速、高通量，可用于14種鄰苯二甲酸酯雌激素的測定。

凝膠凈化；高效液相色譜；辣椒醬；鄰苯二甲酸酯

鄰苯二甲酸酯(phthalate acid esters或phthalate esters，PAEs，又稱酞酸酯)作為塑料增塑劑用于增大產(chǎn)品的可塑性和提高產(chǎn)品強度，在醫(yī)藥、化工、化妝品、農(nóng)藥等領(lǐng)域廣泛使用，其中在食品包裝材料尤其是PVC產(chǎn)品中也大量使用。PAEs與塑料基質(zhì)之間沒有形成化學共價鍵，而是以氫鍵和范德華力連接，彼此保持各自獨立的化學性質(zhì)，隨著時間的推移，其可由食品包裝遷移到食品和飲料中。近幾年，人們越來越關(guān)注于PAEs對人類和動物不利影響。大量研究證實，PAEs在人體內(nèi)的殘留將嚴重的影響到人類的生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，影響生物體內(nèi)激素的正常分泌，導致細胞突變，致畸和致癌[1-3]，因此，歐盟、日韓等國家先后禁止或限量鄰苯二甲酸酯增塑劑在食品接觸性和人體接觸性材料中使用，其中最顯著的法令就是歐盟2005/84/EC[4]，我國也將DMP、DBP和DOP三種鄰苯二甲酸酯列入“中國環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單”[5]。2007年5月瑞士蘇黎世對我國出口辣椒醬食品進行查封和退貨，因為包裝瓶蓋內(nèi)墊中含有的鄰苯二甲酸酯(主要是DEHP)污染了內(nèi)裝食品。目前，鄰苯二甲酸酯的檢測方法主要有氣相色譜法[6]、液相色譜法[5,7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-16]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17]。本實驗對市場上辣椒醬進行抽樣檢測，建立同時測定辣椒醬中14種鄰苯二甲酸酯的GPC-HPLC分析方法，旨在為進出口辣椒醬中PAEs監(jiān)督檢測提供技術(shù)支持及為其他塑裝食品中PAEs的檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒醬 市售。

14種鄰苯二甲酸酯類標準品(純度均大于98%) 德國 Ehrensorfer Quality公司；乙腈(色譜純)；超純水由Milli2Q Plus超純水系統(tǒng)制備；其他試劑均為農(nóng)殘級。

標準儲備溶液：分別準確稱取適量的鄰苯二甲酸酯標準品，用甲醇溶解并定容，配制成1g/L標準儲備液，置于冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜(配二極管陣列檢測器) 美國Agilent公司；凝膠滲透色譜、凝膠凈化柱(700mm×25mm，ID glass column Bio Beads (S-X3)-200～400mesh，70g) 美國J2公司。

1.3 樣品前處理

稱取0.5g(精確至0.1mg)樣品于250mL具塞三角瓶中中，加入20mL石油醚，渦旋混合2min，靜置后提取石油醚層，用石油醚反復沖洗殘渣3次每次10mL，合并提取液并經(jīng)10g無水硫酸鈉過濾，濾液氮吹濃縮至干，用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)定容至10mL，渦旋2min，用0.45μm濾膜過濾，濾液經(jīng)凝膠凈化色譜凈化后，收集7.5～10min之間流出液，氮氣濃縮至干，用1.0mL甲醇定容，供HPLC分析。

1.4 色譜條件

1.4.1 凝膠滲透色譜條件

凝膠滲透色譜柱：700mm×25mm ID glass column(Bio Beads (S-X3)-200～400mesh，70g)；檢測波長254nm；流動相：乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)，流量5mL/min，收集7.5～10min餾分于50mL雞心瓶中。

1.4.2 高效液相色譜條件

色譜柱：Warters-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：A水，B乙腈，梯度洗脫(表1)檢測波長：224nm；進樣量：20μL；流速：1mL/min。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

考察不同溶劑(乙醚、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷)、不同提取時間(10、20、30、40、50min)對提取效率的影響，結(jié)果表明，以石油醚超聲提取30min回收率為86.4%～96.1%，滿足標準方法要求。

2.2 凝膠滲透色譜凈化條件的確定

GPC凈化步驟的切割時間主要考慮既能有效除去脂肪，又能保證鄰苯二甲酸酯的回收率，分別用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)配制0.1mg/mL鄰苯二甲酸酯混合標準溶液和50mg/mL玉米油溶液，在254nm采集混合標準溶液、玉米油溶液的凝膠滲透色譜譜圖，見圖1、2。玉米油在4.5min開始餾出，7.5min基本餾完，鄰苯二甲酸酯在7.5min開始餾出，10.0 min基本餾完。因此收集7.5～10.0min餾分，鄰苯二甲酸酯類目標物回收率均在96%以上。

圖1 PAEs的GPC色譜餾分圖Fig.1 Gel permeation chromatogram of mixed PAEs standards using mixed ethyl acetate and cyclohexa as a mobile phase

圖2 玉米油GPC色譜餾分圖Fig.2 Gel permeation chromatogram of corn oil using mixed ethyl acetate and cyclohexa as a mobile phase

2.3 色譜條件的確定

以乙腈-水溶液為流動相，比較梯度洗脫程序?qū)δ繕嘶衔锏姆蛛x度、峰形的影響。采用上述洗脫程序能達到基線分離且峰形好，結(jié)果見圖3。

圖3 14種PAEs標準圖譜Fig.3 Gel permeation chromatogram of mixed PAEs standards using mixed acetonitrile and water as a mobile phase

2.4 線性回歸曲線、檢出限、方法回收率和精密度

實驗用甲醇配制質(zhì)量濃度為1.00、2.00、4.00、10.00、50.00、100.00、200.00μg/mL的混合標準溶液，制備標準曲線，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.998。以空白樣品的3倍信噪比(RSN=3)確定檢出限為0.25～2.0mg/kg(表2)。以10mg/kg空白添加水平，重復3次實驗，計算加標回收率為85.7%～100.8%，重復測定6次，相對標準偏差RSD為0.37%～4.57%。

表2 方法線性方程、檢出限、回收率(添加水平10mg/kg)和RSD(n=6)Table 2 Linear equations, detection limits, recovery rates and relative standard deviations for the determination of PAEs (n=6)

3 結(jié) 論

本實驗建立的以石油醚為提取溶劑、使用超聲提取和凝膠滲透色譜凈化技術(shù)，對辣椒醬中14種PAEs實現(xiàn)同時檢測，可以滿足國際法規(guī)對辣椒醬中PAEs的監(jiān)控要求。本方法回收率高、準確度好、精密度高，結(jié)果令人滿意。

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Simultaneous Determination of 14 Phthalate Esters in Chili Sauce by GPC-HPLC

ZHANG Hui-jun，ZHANG Jing-xuan，LI Hui*，ZHANG Yan
(Key Laboratory of Food Safety of Hebei, Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research,Shijiazhuang 050051, China)

A GPC-HPLC-DAD method was established for the simultaneous determination of 14 kinds of phthalate esters(PAEs) in chili sauce. Samples were extracted with petroleum ether in an ultrasonic field, followed by clean-up by gel permeation chromatography and concentration by nitrogen gas blowing. The chromatographic separation was achieved on Waters-C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) using an acetonitrile-water mobile phase. A HPLC system coupled with a diode array detector(DAD) was used to analyze the analytes. The developed analytical method exhibited a linear correlation coefficient of more than 0.998 and detection limits ranging from 0.25 to 2.0 mg/kg. Spike recovery rates between 85.7% and 100.8% were obtained, with relative standard deviations (RSD) of 0.37%－4.57%. Therefore, this method is a sensitive, rapid high throughout method and has good suitability to be used to analysis 14 kinds of PAEs in chili sauce.

gel permeation chromatography (GPC)；high preformance liquid chromatography (HPLC)；chili sauce；phthalate esters

R994. 6

A

1002-6630(2011)04-0152-03

2010-02-25

河北省科技支撐計劃項目(09227114D；09227134D)

張會軍(1968—)，男，高級工程師，本科，主要從事食品安全風險檢測與評估研究。E-mail：nepp1998@126.com

*通信作者：李揮(1978—)，男，工程師，博士研究生，主要從事食品安全檢驗與風險研判。E-mail：lihui7171@163.com