盧艷 趙恒 閆紅巖 司紅麗 何成強 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟南 250014

新城疫病毒LaSota疫苗株全基因克隆和序列分析

盧艷 趙恒 閆紅巖 司紅麗 何成強 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟南 250014

本文通過RT-PCR的方法對家禽所的新城疫病毒LaSota疫苗株的全長進行分段克隆，通過測序獲得全長序列，該病毒全長為15186bp，將全長序列提交到NCBI GenBank中獲得序列登錄號為JF950510，將其與之前已提交到NCBI GenBank中的LaSota株全長序列（登錄號為AF077761）比較，核苷酸序列有135處變異，各個蛋白的氨基酸序列總共有61處變異。全基因克隆和序列分析為下一步研究LaSota株提供一個良好的方法。

RT-PCR;新城疫病毒;基因組序列

新城疫( Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一種烈性病毒性傳染病，是當今全球范圍內(nèi)最嚴重的家禽傳染病之一[1]。包含6個基因，依次為3’-N P-P-M-FH N-L-5’，分別編碼核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（hemagglutininneuraminidase，HN）、大聚合酶蛋白（large polymerase protein，L）[2]。本研究對其基因組序列進行測定，這對我國NDV開展分子流行病學(xué)和跨種間致病研究提供科學(xué)資料，為今后研制有效的NDV疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒及分子生物學(xué)相關(guān)材料

Ⅳ系La Sota是山東省農(nóng)科院家禽所袁小遠老師惠贈的。SPF（specific pathogen free，無特定病原體）雞胚購買于山東省農(nóng)科院。p M D 18-T，T 4連接酶購買于TaKaRa公司， E.coli DH5 α為本實驗室保存，DNA純化回收試劑盒購買于天根公司。

1.2 病毒的純化與收集：用PBS稀釋La Sota疫苗然后接種于9～11日齡的SPF雞胚中擴增并收集病毒，并通過血凝實驗測得病毒效價為9。

1.3 引物設(shè)計：根據(jù)GeneBank上公布的全基因組序列將全長分別分12段擴增La Sota株基因組，使用primer5設(shè)計每個片段的上下游引物。引物序列如表1。

1.4 RNA的提取及RT-PCR：按照TRNzolA+總RNA提取的實驗步驟抽提RNA，按照廠商提供的TransScript twostep RT-PCR supermix說明書提供的方法進行RT-PCR。

1.5 克隆測序：將擴增得到的各個cDNA片段連接到pMD18-T載體，篩選含目的片段的單菌落，陽性克隆送北京華大測序。將測序結(jié)果依次拼接后得到全長的基因組序列。

2 結(jié)果

2.1 新城疫病毒基因組各片段的克隆和鑒定

利用R T-P C R擴增出了包含了L a Sota全基因序列的12個片段，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測到與預(yù)期大小相同的條帶，各片段克隆到pMD18-T載體上，用菌落PCR和測序的方法檢測出陽性克隆。

2.2 NDV La Sota疫苗株全基因組序列測定

我們測通了NDV LaSota疫苗株全基因組各段cDNA陽性克隆，運用DNAstar拼接出全基因組序列，NDV LaSota疫苗株全長15186bp，符合6的倍數(shù)。含有6個開放閱讀框，各開放閱讀框的大小分別為：1470bp，1188bp，1095bp，1662bp，1734bp，6615bp。我們將拼接完的La Sota的全基因組序列提交到GeneBank上，基因組序列號為JF950510。用MEGA5.0對這株病毒的全基因組序列和GeneBank上已提交的相應(yīng)病毒全基因組序列作比對，發(fā)現(xiàn)相似性高達99%。有意思的是，在La Sota株的1223 7b p處多出一個堿基G，而在12326bp處則發(fā)生了缺失突變，這一變異可能導(dǎo)致30個氨基酸的改變。其他位置的突變有46處。

表1 NDV La Sota基因片段擴增的引物序列

3 討論

在我國，主要是廣泛接種新城疫疫苗來控制該病的爆發(fā)，一些減毒株疫苗如新城疫Ⅳ系（LaSota株）、H株、Rokin株、克隆30，等被廣泛用于預(yù)防NDV[3]。由于減毒活疫苗易于飲水、噴霧、氣霧等使用相對方便，因此常被用于群體免疫，且NDV免疫密度和次數(shù)也遠遠超過世界水平。由于大面積的疫苗使用，新城疫得到了較好的控制，但近些年來，NDV出現(xiàn)了一些新的疫情，即在免疫過的雞群中，即使能產(chǎn)生高的抗體滴度，新城疫仍時有爆發(fā)[4]。大量使用的疫苗株難免流失到環(huán)境中，目前，那些散落在環(huán)境中的疫苗毒株對新城疫病毒本身造成的影響并沒有完全了解。在這里，我們雖然發(fā)現(xiàn)了新城疫疫苗株的突變，但是突變后果完全未知，因此我們應(yīng)該謹慎對待這類新城疫活載體多價疫苗。

本篇論文以家禽所的LaSota疫苗為材料，通過測序得到全長序列。在測序時，我們考慮了PCR過程可能造成基因的變異[5]，故對該病毒基因組的各區(qū)段至少測序三次，綜合多次測序結(jié)果獲得其全長基因序列，因此所獲得的序列應(yīng)該能夠真實反映了該病毒株基因組的核苷酸序列。將我們得到的序列與之前已提交到N C B I GenBank中的LaSota株全長序列（登錄號為AF077761）比較，我們發(fā)現(xiàn)的核苷酸的變異，說明疫苗株在自然免疫中就不斷發(fā)生變異[6]。綜上所述表明新城疫病毒在自然界的選擇壓力與免疫壓力下，其部分生物學(xué)特性已經(jīng)發(fā)生變化，這可能是病毒對外界環(huán)境變化而發(fā)生的一種適應(yīng)性突變的結(jié)果。

這些結(jié)果為了解我國新城疫病毒疫苗的現(xiàn)狀提供了新的信息，也為新型疫苗的研制和開發(fā)提供了理論依據(jù)。

[1]卡爾尼克BW.禽病學(xué)[M].第十版.高福等譯.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999.692- 694

[2]徐文．新城疫疫苗的最新研究進展[J].Poultry Science 2008.6:43- 45

[3]王友華．雞新城疫綜合防控措施，動物醫(yī)院，2010.3:39-40

[4]雍麗．雞新城疫疫苗應(yīng)用的研究進展.甘肅畜牧獸醫(yī)，2010.1:38-40

[5]Alexander,D.J.Newcastle disease [M].Boston:Kluwer Academic Publishers, 1988.147-160.

[6]施少華．番鴨新城疫病毒全基因組序列分析.2006年學(xué)術(shù)年會，2010.669-672.

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.22.073

山東省高等學(xué)校科技計劃項目（J09LCD209-12）和山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目（BS2009NY011）（,BS2010NY029）

盧艷。研究方向：微生物專業(yè)；

何成強，學(xué)歷：博士，職稱：副教授。