張 昕，崔曉東，王轉(zhuǎn)花

(1.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

蕎麥過(guò)敏原特異性抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑制備

張 昕1，崔曉東2，王轉(zhuǎn)花2

(1.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

以天然苦蕎過(guò)敏蛋白包被聚苯乙烯微孔板，以鼠抗人IgE抗體標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，以間接酶聯(lián)免疫吸附法(indirect enzyme-linked immunosorbent assay，IELISA)檢測(cè)病人血清中的特異性抗體，分析并建立關(guān)鍵操作步驟及反應(yīng)條件。結(jié)果表明：ELISA反應(yīng)的最適工作條件為包被的抗原質(zhì)量濃度100μg/mL、陽(yáng)性血清稀釋度1:50、酶標(biāo)二抗稀釋度1:1000，37℃時(shí)封閉的最佳時(shí)間為40min，包被抗原與陽(yáng)性血清中抗體的最佳作用時(shí)間為40min，陽(yáng)性血清與酶標(biāo)二抗的最佳作用時(shí)間為40min。本方法具有良好的特異性、重復(fù)性和精密度。

苦蕎；過(guò)敏蛋白；試劑盒；間接酶聯(lián)免疫吸附法

食物過(guò)敏同保健食品和食品安全等，已成為食品衛(wèi)生研究中的重要問(wèn)題。全球范圍內(nèi)，大約有4%～6%的兒童和2%的成年人有食物過(guò)敏癥[1]。患者一旦發(fā)生食物過(guò)敏，癥狀通常十分嚴(yán)重。目前，我國(guó)對(duì)于食品過(guò)敏研究還沒(méi)有引起足夠的重視，與國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家相比有較大的差距，這對(duì)于我國(guó)全民的身體健康構(gòu)成了很大的威脅。過(guò)敏原無(wú)處不在，因此患者清楚自己對(duì)何種食品過(guò)敏，及早避開(kāi)這些過(guò)敏原就顯得至關(guān)重要。

近年來(lái)，富含生物類黃酮及多種生物活性成分的蕎麥、燕麥等產(chǎn)品不斷問(wèn)世，而食用這些食品引起的不同程度過(guò)敏癥也成為了生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。蕎麥由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)以及藥用價(jià)值，在世界各地已經(jīng)成為一種普遍栽培的作物[2]。近年來(lái)關(guān)于蕎麥過(guò)敏的報(bào)道日益增多，許多人在食用或接觸蕎麥后會(huì)產(chǎn)生休克、哮喘和皮疹等過(guò)敏癥狀[3-7]。目前，有關(guān)蕎麥過(guò)敏的診斷在國(guó)外已有臨床檢測(cè)的產(chǎn)品，但它的檢測(cè)范圍較窄，對(duì)于一些蕎麥過(guò)敏的病例易造成漏檢。間接性ELISA(indirect enzyme linked immunosorbent assay，IELISA)診斷技術(shù)具有特異、敏感、快速、經(jīng)濟(jì)、可自動(dòng)化等特點(diǎn)，是過(guò)敏癥早期快速診斷和免疫抗體監(jiān)測(cè)的有效實(shí)用技術(shù)[8-10]。

對(duì)蕎麥?zhǔn)称愤^(guò)敏的患者首先應(yīng)進(jìn)行過(guò)敏原檢測(cè)，只有明確過(guò)敏原后，才能進(jìn)行下一步針對(duì)性的預(yù)防和治療。本實(shí)驗(yàn)從前期得到的苦蕎種子中，分離純化得到一種分子質(zhì)量為24kD的蛋白質(zhì)，同時(shí)采用基因克隆、定點(diǎn)突變及免疫學(xué)等技術(shù)確認(rèn)其為苦蕎麥?zhǔn)称分械闹饕^(guò)敏原[11-12]。在此基礎(chǔ)上，本研究將通過(guò)分離、純化獲得苦蕎過(guò)敏蛋白純品，并對(duì)ELISA反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，制備一種成本低、特異性高的蕎麥過(guò)敏蛋白ELISA抗體檢測(cè)試劑，為食物過(guò)敏癥患者過(guò)敏原的檢測(cè)、確診提供方法和試劑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

血清來(lái)自于蕎麥過(guò)敏患者(臨床表現(xiàn)為哮喘、變異性鼻炎、皮疹等癥狀)，特異性IgE濃度均大于0.35IU/mL；辣根過(guò)氧化物酶鼠抗人IgE 美國(guó)Southernbiotech公司。

抗原包被液(5 0mmol/L碳酸鹽緩沖液、2.93 g NaHCO3、1.59g Na2CO3、1L ddH2O，pH9.6)，抗體稀釋液(8g NaCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4、0.5mL 吐溫-20、0.01mmol/L PBST、1L ddH2O，pH7.4)，底物-鄰苯二胺溶液(SIGMA FASTTM OPD Tablet Set，Sigma)臨用前配制：0.1mol/L檸檬酸、0.2mol/L Na2HPO4·12H2O、12.5mL蒸餾水，10mg鄰苯二胺，臨用前加質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶液。

酶標(biāo)測(cè)定儀 美國(guó)Bio-RAD公司；CAP系統(tǒng) 瑞典Pharmacia公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原樣品的制備

按照已報(bào)道的苦蕎過(guò)敏蛋白的制備方法[13]，將脫脂蕎麥粉經(jīng)緩沖液抽提、鹽析、透析、離子交換和凝膠過(guò)濾層析，得到電泳純的24kD抗原，將抗原真空凍干，備用。

1.2.2 ELISA最佳反應(yīng)條件選擇

1.2.2.1 陽(yáng)性血清最佳稀釋度與抗原包被濃度的確定

采用方陣滴定法，用包被緩沖液將制備的抗原分別按5、10、20、30、40、50、100、200μg/mL 稀釋后包被ELISA板，抗原在使用前加入吐溫-20，使其終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1%。4℃過(guò)夜包被，倒盡液體，用洗滌液(PBST)洗3次。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的明膠于37℃水浴封閉1h。用洗滌液洗3次，每排1～8孔分別加入按照1:20、1:40、…、1:2560倍稀釋的陽(yáng)性血清，再加入酶標(biāo)二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgE)，洗3次，最后加入鄰苯二胺顯色底物，37℃溫育15min，加入1mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD490處的光密度。

1.2.2.2 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定

用1.2.2.1節(jié)確定的最佳抗原包被濃度包被酶標(biāo)板，陽(yáng)性血清也使用1.2.2.1節(jié)確定的最佳稀釋度。酶標(biāo)二抗稀釋度分別為1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400和1:12800，具體操作同1.2.2.1節(jié)。

1.2.2.3 封閉液最佳作用時(shí)間的確定

使用1.2.2.1節(jié)確定的抗原包被濃度和陽(yáng)性血清稀釋度，使用1.2.2.2節(jié)確定的酶標(biāo)二抗稀釋濃度。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的明膠封閉酶標(biāo)板，分別封閉20、30、40、50、60、70、80、90min，具體操作同1.2.2.1節(jié)。

1.2.2.4 抗原抗體最佳作用時(shí)間的確定

使用1.2.2.1節(jié)確定的抗原包被濃度和陽(yáng)性血清稀釋度，分別作用 20、30、40、50、60、70、80、90min，使用1.2.2.3節(jié)確定的封閉液最佳作用時(shí)間，將酶標(biāo)二抗按步驟1.2.2.2節(jié)選擇的濃度稀釋后加入酶標(biāo)板。具體操作同1.2.2.1節(jié)。

1.2.2.5 陽(yáng)性血清與酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間的確定

陽(yáng)性血清與酶標(biāo)二抗分別作用20、30、40、50、60、70、80、90min，其余步驟使用以上確定的條件進(jìn)行，具體操作同1.2.2.1節(jié)。

1.2.3 ELISA陰、陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)臨界值的確定

取一定數(shù)量的陰性血清樣本，使用已建立的ELISA方法，并參考市售其他食品過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明，確定標(biāo)準(zhǔn)臨界值。大約95%的陰性血清OD值與平均值0.05相近，以陰性參考血清的2倍作為陽(yáng)性判定值。確定P/N＜2.1為陰性、P/N≥2.1為陽(yáng)性(P為陽(yáng)性O(shè)D值、N為陰性O(shè)D值)。依照上述步驟確定的條件，本實(shí)驗(yàn)取陰性血清和陽(yáng)性血清8份進(jìn)行ELISA鑒定，測(cè)量OD490值，以絕對(duì)值法判定結(jié)果。

1.2.4 ELISA質(zhì)量鑒定

將陽(yáng)性對(duì)照血清按照1:50、1:100、…、1:6400倍稀釋，選用質(zhì)量濃度為100μg/mL的苦蕎蛋白進(jìn)行吸收，然后進(jìn)行ELISA特異性檢測(cè)。同時(shí)測(cè)定選用質(zhì)量濃度為100μg/mL的BSA溶液吸收阻斷的陽(yáng)性對(duì)照血清的OD490值與未加抗原的陽(yáng)性對(duì)照血清的OD490值。

另外取2例陰性血清(N1、N2)和3例陽(yáng)性血清(P1、P2、P3)在同一條件和時(shí)間下進(jìn)行ELISA重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)測(cè)定8次，取8次測(cè)定值，計(jì)算其平均值、變異系數(shù)以及相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎過(guò)敏蛋白的純度分析

將苦蕎蛋白的粗提物先后通Sephadex G-100和DEAE-Sepharose CL 6B柱層析分離，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresi，SDS-PAGE)檢測(cè)其純度。圖1顯示，純化的24kD目的蛋白(上樣量為5μg)為單一條帶，純度達(dá)到9 5%以上，可滿足后續(xù)研究。

圖1 目的蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified protein from tartary buckwheat

2.2 ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

2.2.1 陽(yáng)性血清最佳稀釋度與最佳抗原包被濃度的確定

采用方陣滴定測(cè)定了陽(yáng)性血清最佳稀釋度和最佳抗原包被濃度，結(jié)果顯示當(dāng)抗血清的稀釋濃度為1:40和1:80時(shí)，各稀釋度的抗原OD值均較高(表1)。為了取樣方便，選定1:50作為最佳的稀釋度。當(dāng)包被抗原質(zhì)量濃度為100μg/mL時(shí)，各稀釋度的抗體即陽(yáng)性血清的OD值最大，而當(dāng)包被質(zhì)量濃度為200μg/mL的時(shí)候，OD值較小，原因可能是，質(zhì)量濃度太高時(shí)，空間因素影響了抗原抗體的結(jié)合。最后確定100μg/mL、1:50為抗原包被與抗血清稀釋的工作濃度。

表 1 包被抗原和抗血清濃度的方陣滴定Table 1 Titration matrix of coating antigen and positive antiserum dilution

2.2.2 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定

在確定最佳血清稀釋度和最佳包被條件的情況下，進(jìn)一步確定酶標(biāo)二抗的稀釋度。從圖2可以看出，當(dāng)稀釋倍數(shù)處于1:100～1:400之間時(shí)，因?yàn)槊笜?biāo)二抗過(guò)量，容易造成非特異性吸附，因此OD值較高；當(dāng)倍數(shù)大于1:1600時(shí)，由于抗體量不足，造成光密度值較小。因此比較適宜的稀釋倍數(shù)為1:400～1:1600，本研究選定1:1000為最佳稀釋度。2.2.3 封閉液最佳作用時(shí)間的確定

圖2 酶標(biāo)二抗最適濃度的確定Fig.2 Determination of optimal working concentration of HRP-labeled mouse anti-human IgE

在ELISA反應(yīng)中，封閉液的封閉效果和均一性對(duì)于實(shí)驗(yàn)的結(jié)果至關(guān)重要。因此本研究選用純度較好的明膠作為封閉液，以減少實(shí)驗(yàn)的誤差。在封閉液確定的條件下對(duì)封閉的時(shí)間進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)在40～60min之間時(shí)，OD值比較穩(wěn)定(圖3)，最終確定40min為最佳封閉時(shí)間。

圖3 封閉液最佳作用時(shí)間的確定Fig.3 Determination of optimal blocking time

2.2.4 抗原抗體最佳作用時(shí)間的確定

包被抗原和血清中抗體的結(jié)合強(qiáng)度和特異性程度是ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否穩(wěn)定的因素之一。通過(guò)對(duì)抗原抗體的最佳作用時(shí)間進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)在30～60min范圍內(nèi)，OD值處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平(圖4)，而作用時(shí)間大于60min后，OD值明顯偏大，最終選定最佳作用時(shí)間為40min。

圖4 抗原抗體最佳作用時(shí)間的確定Fig.4 Determination of optimal incubation time of antigen and antibody for conjugation

2.2.5 陽(yáng)性血清與酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間的確定

陽(yáng)性血清與酶標(biāo)二抗的作用時(shí)間研究結(jié)果如圖5顯示，在兩者作用40～60min之間，OD值比較穩(wěn)定，因此選定40min為最佳作用時(shí)間。

圖5 酶標(biāo)二抗與陽(yáng)性血清最佳工作時(shí)間的確定Fig.5 Determination of optimal working time of HRP-labeled mouse anti-human IgE and patients’positive sera

2.3 陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)臨界值的確定

因?yàn)槊看螌?shí)驗(yàn)條件(包括試劑配制)會(huì)存在差異，一般采用標(biāo)本(P)與陰性對(duì)照(N)比值(P/N)的方法確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果屬于陽(yáng)性還是陰性。在得出標(biāo)本和陰性對(duì)照的OD值后，計(jì)算P/N值。P/N＜2.1為陰性、P/N≥2.1為陽(yáng)性，因此，標(biāo)準(zhǔn)臨界值＝2.1×陰性對(duì)照OD值。本實(shí)驗(yàn)將緩沖液作為陰性對(duì)照。為避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，對(duì)N值作一些特殊規(guī)定，即如果實(shí)驗(yàn)中N值小于0.05，則按0.05計(jì)算。經(jīng)測(cè)量后，8份陽(yáng)性血清OD值均大于0.15，P/N≥2.1，符合測(cè)定需要。

2.4 ELISA質(zhì)量判定

2.4.1 ELISA特異性實(shí)驗(yàn)

阻斷實(shí)驗(yàn)顯示用苦蕎抗原吸收不同稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照血清后，陽(yáng)性血清的OD490值明顯降低。而用BSA吸收阻斷的陽(yáng)性對(duì)照血清后所測(cè)的OD490值，與未加抗原的陽(yáng)性對(duì)照血清的OD490值沒(méi)有差異。說(shuō)明本方法具有良好的特異性。

2.4.2 ELISA重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

選取2例陰性血清和3例陽(yáng)性血清在同一時(shí)間(t1)和條件下重復(fù)測(cè)定8次，結(jié)果顯示其OD490值變化不顯著，陽(yáng)性樣本P1、P2、P3變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明本方案的精密度比較高。又在不同時(shí)間(t2)重復(fù)測(cè)定8次，所測(cè)定的8次變異系數(shù)不超過(guò)10%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從苦蕎種子中分離純化得到一種苦蕎麥過(guò)敏蛋白，純度達(dá)到95%以上，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法初步建立了此過(guò)敏原的特異性抗體檢測(cè)方法，確定用ELISA檢測(cè)抗血清時(shí)的最適工作條件為包被的抗原質(zhì)量濃度100μg/mL、陽(yáng)性血清稀釋度1:50、酶標(biāo)二抗稀釋度1:1000，37℃時(shí)封閉的最佳時(shí)間為40min，包被抗原與陽(yáng)性血清中抗體的最佳作用時(shí)間為40min，陽(yáng)性血清與酶標(biāo)二抗的最佳作用時(shí)間為40min。ELISA進(jìn)行的8次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示變異系數(shù)較低，證實(shí)本方法具有良好的重復(fù)性，并且精密度也較好。

制備一個(gè)穩(wěn)定且成熟的特異性過(guò)敏原檢測(cè)試劑需要通過(guò)大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)和臨床檢測(cè)，血清的樣本數(shù)、抗原的純度、包被濃度、反應(yīng)時(shí)間及溫度等都會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。本研究根據(jù)間接ELISA方法初步研制的檢測(cè)手段具有一定的特異性和穩(wěn)定性，而對(duì)于蕎麥?zhǔn)称愤^(guò)敏原檢測(cè)試劑的商品化開(kāi)發(fā)還需要進(jìn)一步研究。

[1] LARS K P.In vivoandin vitrotechniques to determine the biological activity of food allergens[J]. Journal of Chromatography B, 2001, 756(1/2): 41-55.

[2] FABJAN N, RODE J, KOSIR I J, et al. Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricumGaertn.) as a source of dietary rutin and quercitrin[J]. J Agric Food Chem, 2003, 51(22): 6452-6455.

[3] WIESLANDER G. Review on buckwheat allergy[J]. Allergy, 1996, 51(10): 661-665.

[4] URISU A, KONDO Y, MORITA Y, et al. Identification of a major allergen of buckwheat seeds by immunoblotting methods[J]. Allergy Clin Immunol News, 1994, 6(5): 151-155.

[5] PARK J W, KANG D B, KIM C W, et al. Identification and characterization of the major allergens of buckwheat[J]. Allergy, 2000, 55(11):1035-1041.

[6] MATSUMOTO R, FUJINO K, NAGATA Y, et al. Molecular characterization of a 10-kDa buckwheat molecule reactive to allergic patients’IgE[J]. Allergy, 2004, 59(5): 533-538.

[7] CHOI S Y, SOHN J H, LEE Y W, et al. Characterization of buckwheat 19-kD allergen and its application for diagnosing clinical reactivity[J].Int Arch Allergy Immunol, 2007, 144(4): 267-274.

[8] 陳雪嵐, 金晶, 楊曉慧. 恩諾沙星快速酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒的研制[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(8): 16-19.

[9] 黨華, 黃志堅(jiān), 邱于斌, 等. 變應(yīng)原特異性IgE抗體檢測(cè)試劑盒的研制[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2010, 28(4): 269-270.

[10] 張瑜, 徐國(guó)景, 唐利軍, 等. 用間接酶免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)犬狂犬病毒IgG試劑盒及制備方法: 中國(guó), CN1547027A[P]. 2004-11-17.

[11] ZHANG Xin, YUAN Jingming, CUI Xiaodong, et al. Molecular cloning,recombinant expression, and immunological characterization of a novel allergen from tartary buckwheat[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(22):10947-10953.

[12] 任曉霞, 張昕, 崔曉東, 等. 過(guò)敏原TBa的表位突變及免疫活性鑒定[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(13): 169-173.

[13] WANG Zhuanhua, ZHANG Zheng, ZHAO Zhuohui, et al. Purification and characterization of a 24 kDa protein from tartary buckwheat seeds[J].Biosci Biotech Biochemic, 2004, 68(7): 1409-1413.

Preparation of an ELISA Method for Determining Buckwheat Allergen

ZHANG Xin1，CUI Xiao-dong2，WANG Zhuan-hua2
(1. Research Center for Environmental Science and Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (IELISA) was proposed to detect specific antibodies in tartary buckwheat allergenic patients,sera using polystyrene micro-well plate coated with natural tartary buckwheat allergenic proteins and horseradish peroxidase (HRP)-labeled mouse anti-human IgE. Key operations and reaction conditions were optimized. The results showed that the optimal coating antigen concentration, positive serum dilution, HRP-labeled mouse anti-human IgE concentration, blocking time at 37 ℃, reaction time between coating antigen and antibodies in positive sera, and reaction time between positive sera and HRP-labeled mouse anti-human IgE were 100 μg/mL, 1:50, 1:1000, 40 min, 40 min and 40 min,respectively. This method proved highly specific, repeatable and sensitive.

tartary buckwheat；allergen；kit；indirect enzyme-linked immunosorbent assay (IELISA)

R392.11

B

1002-6630(2011)20-0327-04

2010-12-27

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20100321101)；太原市技術(shù)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2010-09)

張昕(1981—)，女，副教授，博士，主要從事環(huán)境科學(xué)與免疫學(xué)研究。E-mail：xinzhang0051@sxu.edu.cn